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分享總結Western跑磷酸化蛋白的要點
發布時間: 2021-09-17 點擊次數: 2917次抗體
工欲善其事必先利其器,抗體很關鍵。這里我們要說的并不是最貴的就是好的,如果條件允許,建議同時購買不同廠家的抗體,一起來試一試,因為有時候即使是好的品牌,不同批次穩定性也不一樣。抗體從訂購到到貨有一定的時間,所以到貨后請盡快分裝好,準備做實驗,如果實驗進度跟不上的問題,導致抗體到了后拖了很久才正式實驗,這樣拖了時間找廠家售后申訴也是很被動的。用 CST 的一抗,效果不穩定,也可能跟抗體放久了有關。最后買了另一家代理的抗體算是有了比較穩定的結果。當然,還是選擇購買口碑較好的公司的產品為佳,這樣即使出了問題售后也會跟進。如果經費有限,可以買買小包裝的產品先試試,不少抗體公司還有 5ul 的抗體試用裝免費申請。再者,孵育一抗的時候,建議用新鮮抗體,什么意思呢?很多同學因為想圖省事兒,很多時候配好孵育液,每次孵育好之后再次放進冰箱等待下次重復利用,一些比較好跑的蛋白到時沒啥問題,但是磷酸化的蛋白建議每次都用新鮮的抗體原液,將條帶剪下來后用雜交袋塑封 好,按 1:1000 的比例加入抗體原液孵育,再這種情況下,100ul 的抗體也是能用很久的,所以盡量每次都用新的抗體。
蛋白上樣
普遍反映磷酸化的條帶很淡,有時候達不到制圖標準,這點可以加大上樣量來解決,另外,磷酸化蛋白一般與非磷酸化的蛋白一起跑一起制圖,它本來就是要比非磷酸化的要淡一些,不要過分擔心。
電泳
不同 kb 的蛋白電泳時間有所差別,參數啥的要用腦子更改,不能一成不變,避免發生那種蛋白跑不見了的慘劇。
封閉
這個步驟非常重要,強推 BSA 封閉,不要用脫脂奶粉封閉,BSA 封閉對磷酸化的抗體效果非常好,而且也不貴。另外,BSA 封閉液倒是可以反復使用不至于向奶粉一樣臭掉,用來孵育一般非磷酸化的抗體,效果同樣棒棒噠! 再者,封閉時間可以延長,一般封閉 2-3 小時的情況下,可以封閉延時到 4 小時,所以按照從早到晚做實驗的時間,用 BSA 配好封閉液開始封閉的時候,您就可以慢慢的約個火鍋唱個歌再回來了,實驗本來就很辛苦,不要再依賴外賣小哥了。
洗膜
嚴格遵守洗膜時間,不得減少次數,每個步驟洗 3 次,每次可以洗長一點,比如(11-12 分鐘)。
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