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清晰的條帶是這樣跑出來(lái)的——western blot八大秘訣!
發(fā)布時(shí)間: 2021-09-17 點(diǎn)擊次數(shù): 5651次1.制膠:
先制分離膠,再制濃縮膠,嚴(yán)格按照制膠說(shuō)明書來(lái)就可以了。需要注意的一點(diǎn)是制膠一定要混勻!混勻!混勻!個(gè)人經(jīng)驗(yàn)是每加一種試劑,就混勻一下,直到最后一種試劑加完。
對(duì)于初學(xué)者,還要區(qū)分制膠的玻璃板是 1.0cm 還是 1.5cm 的,兩者需要的制膠液體量是不一樣的。另外,玻璃板一定要洗干凈,本人平時(shí)都是用洗潔精洗干凈然后用水沖洗最后用純水沖洗,再放在烤箱里烤干并晾至室溫。
2.點(diǎn)樣:
點(diǎn)樣的過(guò)程很簡(jiǎn)單,表手抖就 OK 了。再者,點(diǎn)樣的過(guò)程一定迅速,不然前面的樣容易彌散,雖說(shuō)不至于太影響結(jié)果,但對(duì)于有強(qiáng)迫癥的同學(xué)來(lái)說(shuō)還是比較致命的傷害。
3.跑膠:
注意,跑膠時(shí)也會(huì)出現(xiàn)各種烏龍,如果跑了好大一會(huì)兒還不見條帶下移,請(qǐng)看一下你的玻璃板是否放反;如果跑膠時(shí)發(fā)現(xiàn)溫度過(guò)高,可檢查一下正負(fù)極是否連接反了。跑膠建議恒壓,80V 30min, 120V 60min(這個(gè)得具體看目的條帶的 位置,時(shí)間可相應(yīng)增減)
4.轉(zhuǎn)膜:
請(qǐng)牢記轉(zhuǎn)膜順序(黑色面-濾紙-海綿-膠-膜-海綿-濾紙-白色面),如若搞不清楚,可想象一下,蛋白質(zhì)是帶負(fù)電荷的,應(yīng)該是往正極方面跑,所以膜應(yīng)該放在正極面。轉(zhuǎn)膜時(shí)要恒流, 285mA—300mA 60min。特別注意的是跑膠時(shí)恒壓,轉(zhuǎn)膜時(shí)恒流這個(gè)條件。
5.封閉特異性抗原:
封閉和孵育抗體也是非常關(guān)鍵的步驟,封閉建議大家用 5%的脫脂奶粉, 2 個(gè)小時(shí)(或者過(guò)夜),不建議用 BSA。
6.一抗孵育:
封閉完以后不用洗直接孵育一抗,一抗配置溶液是 3% BSA 的 TBST(注意封閉和抗體孵育用的蛋白,封閉用牛奶,抗體孵育用 BSA,這個(gè)條件是決定條帶是否齊整及有無(wú)雜帶的關(guān)鍵),過(guò)夜(或 2 個(gè)小時(shí))。時(shí)間上與封閉錯(cuò)開,如若封閉過(guò)夜,則一抗只需要兩個(gè)小時(shí)。
7.二抗孵育:
洗三遍后孵育二抗 1 小時(shí),洗的時(shí)間很重要,習(xí)慣是洗三遍,第一二三次分別是 5min、10min、15min。還要特別強(qiáng)調(diào)的是,孵育和洗膜用的轉(zhuǎn)速是不一樣的。孵育是低速,使膜和抗體有充分的接觸時(shí)間;洗膜時(shí)要用高速,以使膜洗得干凈。還有,一抗孵育時(shí)正面朝下,封閉和二抗孵育時(shí)都是朝上。(表問(wèn)為什么,不知道,經(jīng)驗(yàn)之談)
8.曝光:
當(dāng)滿足了所有以上的實(shí)驗(yàn)條件之后,你就可以自信滿滿地去曝光了。相信我,不管是磷酸化的還是普通的蛋白,都會(huì)出現(xiàn)平整光滑的條帶。
最后說(shuō)一下配置實(shí)驗(yàn)所需的各種溶液:TBST 可以買,也可以自己配置;同時(shí) TBST 可以用 PBST 代替,即 PBS 加吐溫就可以了。封閉和抗體孵育時(shí)所用的 5%的脫脂奶粉和 3%的 BSA 都是用 TBST 配置。洗膜時(shí)用 TBST 和 PBST,這個(gè)就不用說(shuō)了吧。
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