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    qPCR實驗為什么要制作熔解曲線?

    發布時間: 2021-10-11  點擊次數: 4185次

    熒光DNA結合染料法的缺點是它們能在反應中結合所有DNA雙鏈,包括在實時熒光PCR中產生的引物二聚體,和其他非特異性產物,引起大量的背景噪聲信號。


    這種噪聲會影響我們對靶基因產量的評估,甚至熒光強度和靶基因的起始量、全長根本沒什么關系。


    因此,我們使用熒光DNA染料結合法時,需要對擴增產物進行熔解曲線的分析。通過對擴增反應產物逐漸升溫,同時監測每一步的熒光信號來制作熔解曲線。

    qPCR實驗為什么要制作熔解曲線?.png

    熔解曲線的縱坐標是熒光信號值,橫坐標是溫度值。通過觀察產生的信號峰和對應溫度,可以判斷產物狀態。


    理想情況下,熔解曲線應該是單峰,峰值對應溫度是特異性產物的退火溫度,這才能說明擴增產物中特異性產物占比大。熒光DNA結合染料法的缺點是它們能在反應中結合所有DNA雙鏈,包括在實時熒光PCR中產生的引物二聚體,和其他非特異性產物,引起大量的背景噪聲信號。

    qPCR實驗為什么要制作熔解曲線?.png

    這種噪聲會影響我們對靶基因產量的評估,甚至熒光強度和靶基因的起始量、全長根本沒什么關系。


    因此,我們使用熒光DNA染料結合法時,需要對擴增產物進行熔解曲線的分析。通過對擴增反應產物逐漸升溫,同時監測每一步的熒光信號來制作熔解曲線。


    熔解曲線的縱坐標是熒光信號值,橫坐標是溫度值。通過觀察產生的信號峰和對應溫度,可以判斷產物狀態。


    理想情況下,熔解曲線應該是單峰,峰值對應溫度是特異性產物的退火溫度,這才能說明擴增產物中特異性產物占比大。


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