1. 將含有凍存 HeLa S3 細胞的安瓿放入 37℃ 水浴中解凍。

2. 用 70% 乙醇對安瓿的頂端進行消毒，打開安瓿，用吸管將細胞轉移到含有 5 ml * MEM-10 培養基的 25 cm2 組織培養瓶中，輕輕搖動培養瓶，使細胞均勻分布于培養瓶中，放入 5% CO2 加濕培養箱中 37℃ 培養過夜。

3. 將培養基吸出，用 0.5 ml 37℃ 的胰酶/EDTA 覆蓋細胞，消化 30～40 s。

4. 加入 10 ml 旋轉瓶*培養基-5，并將細胞轉移至 50 ml 的離心管中。室溫 1800 g 離心 5 min，棄上清。

5. 將細胞沉淀懸浮在 5 ml 的旋轉瓶*培養基-5 中，上下吹打，將細胞團打散。

6. 在 100 ml 或 200 ml 通氣旋轉瓶中加入 50 ml 旋轉瓶*培養基-5，并將細胞懸液轉移到瓶中。

7. 取出 1 ml 細胞懸液，用血細胞計數器（附錄 3F) 進行細胞計數。加入適量的旋轉瓶*培養基-5，使細胞密度為（3～4）× 105 細胞/ml。將細胞放入無 CO2 培養箱，37℃ 旋轉培養。

8. 隨后的兩天讓細胞繼續生長，并且每天對細胞進行計數，加入適量的旋轉瓶*培養基-5 以維持（3～4）×105 細胞/ml 的細胞密度。

9. 取 1 ml 的細胞懸液，用血細胞計數器對細胞進行監測。

10. 當細胞密度達到（4～5）×105 細胞/ml 時，隔天或每天用培養基將細胞稀釋至 1.5×105 或 2.5×105 細胞/ml。

11. 分別將裝有 50 ml 或 100 ml 細胞懸液的 100 ml 或 200 ml 通氣旋轉瓶放入 37℃ 無 CO2 培養箱旋轉培養。每天或隔天傳代。