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純化質粒(堿裂解法)
發布時間: 2021-11-18 點擊次數: 1077次材料與儀器
大腸桿菌
LB 葡萄糖緩沖液 乙酸鉀
離心管步驟
1. 單個大腸桿菌克隆接種到 2 ml 含適當抗生素的 LB 中。37℃ 劇烈振蕩孵育 5~8 小時。或者可以培養過夜使飽和。
2. 倒 1.5 ml 培養液到已作標記的微量離心管中。把剩下的培養液存放在 4℃。
3. 在微量離心機上離心 2 分鐘以沉淀大腸桿菌。吸掉培養液。
4. 用 100 ul 葡萄糖緩沖液重懸沉淀物。在室溫孵育 5 分鐘。在這時候充分懸浮大腸桿菌對于獲得盡可能大的產量是很重要的。
葡萄糖緩沖液(配 500 ml)
50 mmol/L 葡萄糖 4.5 g 葡萄糖
10 mmol/L EDTA,pH 8.0 10 ml 0.5 mol/L EDTA,pH 8.0
25 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0 12.5 ml 1.0 mol/L Tris-HCl,pH 8.0
過濾除菌,貯存在 4℃。
5. 在管中加 200 ul NaOH-SDS 溶液,輕輕地顛倒混合。冰浴 5 分鐘。溶液應該明顯變清了,但仍然非常黏。
NaOH-SDS 溶液(配 50 ml)
0.2 mol/L NaOH 0.4 g NaOH
1% SDS 2.5 ml 20% (w/v) SDS
可在室溫存放 2~3 周。
6. 每個管中加 150 ul 冷的 3 mol/L 乙酸鉀,pH 5.2,顛倒混合;冰浴 5 分鐘,會形成白色絮狀沉淀。
3 mol/L 乙酸鉀:
5 moI/L 乙酸鉀 60 ml
冰乙酸 11.5 ml
加水到 100 ml。貯存在 4℃。
7. 在小離心機上離心 5 分鐘,然后轉移 400 ul 上清到一個已作標記的管中。
8. 管中加 0.5 ml 酸/氯仿/異戊醇(50:49:1) 溶液,振搖,在離心機上離心 5 分鐘。
酚/氯仿/異戊醇(50:49:1)
50% TE 飽和酚
49% 氯仿
1% 異戊醇
避光貯存于 4℃。
9. 小心地把水相(上層)轉移到已作標記的管中。
10. 加 1.0 ml 100% 乙醇,混合,然后離心 5 分鐘沉淀 DNA。
11. 去掉上清。應該能看到一個小的白色沉淀物。加 1.0 mI 70% 乙醇洗滌沉淀物,并離心 5 分鐘。
12. 去掉上清。管子離心 5 秒鐘使殘余液體流到管底。吸掉液體,讓乙醇揮發 5~10 分鐘。(或者可以真空干燥管子。)
13. 用 25~50 ul 的 TE(pH 8.0)重懸沉淀物。質粒 DNA 應該很容易溶解。不易溶解的物質很可能不是 DNA。
14. 在這 32 uI DNA 溶液中加 8.0 ul 4 mol/L NaCl 和 40 ul 113% (w/v) PEG8000。混合均勻并冰浴 1 小時或更長時間。
15. 用小離心機在 4℃ 離心 15 分鐘以沉淀 DNA。
16. 小心去掉上清并加 1.0 ml 70% 乙醇洗滌沉淀物,離心 5 分鐘。
17. 小心去掉乙醇,離心 5 秒鐘使殘余液體流到管底。吸掉液體并讓乙醇揮發 5~10 分鐘。
18. 根據測序方法的要求用 20~30 ul TE 或水重懸沉淀物。- 下一篇:從培養的細胞中純化總RNA的方法
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