1. 抗原的密度

①　高表達的抗原可選擇幾乎所有的熒光素；

②　低密度表達的抗原需要可提供較高S/N比值的熒光素如PE/APC。

2. 自發熒光

①　每種細胞群都有不同水平的自發熒光；

②　所有的熒光通道均可觀察到自發熒光，但自發熒光強度在波長較長時迅速降低；

③　對自發熒光較強的細胞，選擇發射波長較長的熒光素（如APC）可得到較好的S/N比值；

④　對自發熒光比較弱的細胞，發射波長較長的熒光素對S/N提高沒有明顯的改善。可選用FITC。

3. 非特異結合

①　許多熒光抗體可產生低水平的非特異結合，使陰性細胞群的熒光超出自發熒光；

②　非特異結合由下列因素引起：

單克隆抗體的同型抗體：一些IgG同型抗體可能與一些細胞上的Fc受體結合；

所用的熒光素：羰花青染料（如CY3、CY5、CY5.5、CY7）和Tex-Red直標的抗體及一些復合染料標記的抗體在標記某些亞群的細胞時有時會提高結合率；對CY5來說，是因為該染料與低親和力Fc受體的極低親和力相互作用。這也是復合染料PE-CY5的特性。

4. 復合染料：小心信號衰退

①　復合染料因為光、固定劑或溫度升高會致信號衰退，是復合染料在上一級染料處發光。該種現象從一小部分亞群開始，導致APC或PE染色細胞群假陽性；

②　減少樣本暴露于光、高溫或固定劑，可很大程度上避免這一問題；

③　選擇染料時需要考慮：復合染料的信號衰退會不會降低APC或PE的靈敏度。如果是，就要選擇另外的試劑搭配；

④　如果樣本需要固定，要選擇穩定的固定劑，可有效阻止復合染料的信號衰退。

5. 熒光信號之間的干擾，會增加信號檢測背景

①　熒光信號強細胞群體的SD比熒光信號弱的細胞群體大；

②　多色分析時，一種熒光素（如FITC）的光會漏入相鄰的熒光素（如PE）的檢測器。漏入的光越多，需要補償的越多，對分辨率的影響就越大。尤其是弱表達的信號。

6. 盡量減少熒光信號之間的干擾

①　檢測的顏色越多，面臨的熒光信號之間的干擾越多；

②　選擇試劑組合時盡可能降低熒光發射波長之間的重疊。

7. 儀器配置的差異，多色分析不可能全選“最亮"的熒光素，但對于特定的一款儀器，可以根據熒光的強弱列出可選的染料。

8. 亮度的判斷：就是熒光染料的靈敏度，區分背景和弱陽性信號的能力。

9. 影響背景的因素有檢測器的電子噪音、細胞自發熒光、來自其他檢測器的信號干擾，這些因素也增加了陰性熒光峰的寬度（標準差）。

10.靈敏度好的標準是染色指數：D/W，D指的是陽性峰與陰性峰的平均熒光強度的差；W是陰性峰的2SD。