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    CAT活性的相-抽提分析法

    發布時間: 2021-12-16  點擊次數: 1111次

    材料與儀器

    轉染細胞
    氯霉素 Tris·Cl TMPD 二甲苯
    離心機 離心管 培養箱

    步驟

    一、來源于哺乳動物細胞

    1.  按“CAT活性的層析分析法"中的步驟1~5的凍融法,制備哺乳動物細胞提取物。如果用胰蛋白酶消化或制細胞方法來收集細胞,則將原位裂解法的步驟1至4用以下的步驟2至4代替。

     
    2.  室溫下,300 g 離心5 min,棄去上清。每107細胞加入1 ml 低滲緩沖液,離心,棄上清。然后每107細胞加Triton裂解液200 μl。

    二、來源于植物原生質體
     
    1.  室溫下,2 000~4 000 g 離心5 min,將植物原生質體細胞收集于1.5 ml 的微量離心管中,棄去上清。

    2.  往細胞沉淀加50 μl 低滲緩沖液,在旋渦混合器上劇烈振蕩,將離心管置于-70℃ 15 min以上,或置于干冰/乙醇浴中5 min 以凍結樣品。融解樣品,在室溫下13 000  g 離心2 min,將上清移入一個干凈管中。

    3.  對于分析50 μl 細胞提取液,配置如下CAT分析混合液
    20 μl  0.01 μCi/μl [3H]氯霉素
    5 μl  5 mg/ml 丁酰輔(酶)A
    5 μl  2 mol/l Tris·Cl,pH8.0
    20 μl  H2O
     
    4.  對每組分析,將50 μl CAT分析混合液加入50 μl 細胞提取液中。37℃溫育30~90 min。
     
    5.  用200 μl 2:1的TMPD/二甲苯劇烈報蕩提取乙酰化的氯霉素,離心并移出上層液相至一只閃爍瓶中。

    6.  樣品中加3~5 ml 閃爍液,計數測定CAT的活性。


    同實驗其他方法

    CAT活性的層析分析法

    1.  100 mm 培養皿中的轉染了CAT表達質粒的貼壁細胞,用PBS洗兩次,每次5 ml每培養皿加入1 ml TEN溶液。將細胞置于冰浴5 min。   2.  用橡膠

    原位裂解細胞的CAT分析法

    1.  60 mm 培養皿中轉染了CAT表達質粒的細胞,用2 ml PBS洗1次。每培養皿加入2 ml 低滲緩沖液,在室溫下溫育2~5 min。 2.  吸去低滲緩沖液,加入400 μl T

    人生長激素的放射免疫分析法

    1.  取轉染了hGH表達質粒的哺乳動物細胞的培養液100~500 μl。 2.  加100 μl 培養液或標準品至12 mm×75 mm 圓底試管中。加入100 μl 125I-

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