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    Real-time PCR實驗攻略（基本方法二）

    發布時間： 2022-03-11　　點擊次數： 2900次

    材料與儀器

     

    一、關于Trizol Reagent需要的試劑
     
    1. Chloroform：氯仿 (分析純)
     
    2. Isoproplyl alcohol：異丙醇(分析純)
     
    3. 75% Ethanol（in DEPC-treated water）:75%乙醇。要求用分析純無水乙醇并用0.01%的DEPC處理過的無Rnase的水稀釋。
     
    4. RNase-free water：無Rnase的水。方法是：將DEPC按0.01%（V/V）加在dH2O中500 ml（50 ul），在37 ℃過夜，并高壓滅菌即得（150 ℃ 3小時）
     
    5. 一次性塑料手套
     
    6. 注意：DEPC有致癌之嫌
     
    7. 抽提出的細胞總RNA干燥后加水50 ul，取10 ul加無Rnase水990 ul，稀釋100倍成1 ml。于0.5 cm厚的石英比色杯中，以無Rnase水為對照，在721型紫外分光光度計下檢測，結果應為：A260/280 ratio <1.6。
     
    8. 分離組織10 mg（純組織）加800 ul Trizol試劑。

     

     

    步驟

     

    二、DEPC處理方法如下

     

    1. DEPC處理

    （1）DEPC水：100 ml超純水加入0.2 ml DEPC，充分混勻，高壓滅菌。

    （2） Tip頭(槍頭）. EP管等在提RNA過程中及做RT時接觸RNA的器材（包括1 ml. 200 μl. 20 μl Tip頭；EP管和PCR反應管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超純水加入1ml DEPC）37 ℃浸泡過夜，高壓滅菌。

     

    2. 提取RNA，用DEPC水溶解

     

    3. RT 我是用PCR儀來控制溫度和時間的，所以RT是在PCR反應管中作的。

     

    4. 操作過程中要戴一次性手套，并經常換手套。 最好把要直接接觸樣品的東西都用DEPC水處理一下，槍頭盒插好槍頭后，加入1-2 ml的0.1%DEPC水，再滅菌就行了；現在有進口的RNASE FREE的槍頭買，直接用不用處理的。
    三、如何消除污染
     
    機器運行完后，取出PCR產物時不能隨便丟棄，應該用塑料手套或其他打結包好后丟入垃圾桶。
     
    （1） 試劑：mixer盡量分裝，不要原瓶多次取用。
     
    （2） 加樣：原則是DNA最后加，其他試劑按照體積大小從大往小的加。如果是同種引物和探針有多管的話只是DNA不同，那么采取的方法是算出總體積后加在一個管子里面，混合均勻之后再分裝到各個管子里去，這樣可以有效地避免誤差及污染。 另外，普通實驗室容易污染，且污染程度很高，與跑電泳還有質粒制備提取都在同一個房間里有比較大的關系，最容易造成高濃度污染的就是產物的開蓋和質粒的稀釋。 目前，國內外各個公司提供的診斷試劑盒大多采用了UNG來防污染。Uracil-DNA N-glycosylase（UNG）尿嘧啶DNA糖基酶，來源于大腸桿菌重組克隆表達。
     
    四、RNA定量
     
    RNA也最好至少要用電泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度計比較不同標本之間就更不準了。 RNA的貯藏，最主要的是溫度，-20不夠，最好-80，液氮最保險 mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因為還有翻譯效率和RNA降解速度的影響。
     
    五、RT-PCR有兩種做法
     
    條件具備的話可用kit進行一步法進行；若條件不太好的話可分兩步進行逆轉錄再PCR。但后來發現兩步法的結果更加理想，條帶特異性強且無拖尾現象，我推測是體系更加單一比較利于PCR的進行 一定要做內參的，每一次，我想。不作內參的結果是不可信的 電泳可以不一起跑，沒有關系，計算的是相對表達程度，半定量和定量RT-PCR做的都是基因相對表達量，不是絕對表達量。
     
    六、mRNA的分離與純化
     
    步驟（4）中將RNA溶液置65 ℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結構，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級結構，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結合，否則會導致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。
     
    七、下面，我們介紹一個可以確認RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法：
     
    保溫試驗方法很簡單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1 000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,并且用pH7.0的Tris緩沖液補充到10 ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70 ℃的恒溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20 ℃冰箱中保存1 h。 時間到了之后，取出兩份樣本進行電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別（當然，它們的條帶也要符合方法2中的條件）， 則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質量很好。相反的，如果70 ℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶污染。
     
    八、PCR污染與對策
     
    1.  PCR擴增產物污染
     
    這是PCR反應中最主要常見的污染問題，所以，擴增區的儀器什么如槍頭等要注意。 還有一種容易忽視，最可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染.據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。
     
    1)標本處理區，包括擴增摸板的制備；
     
    2)PCR擴增區，包括反應液的配制和PCR擴增；
     
    3)產物分析區，凝膠電泳分析，產物拍照及重組克隆的制備。
     
    各工作區要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標本制備→PCR擴增→產物分析→產物處理。 切記：產物分析區的產物及器材不要拿到其他兩個工作區。 使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染； 操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度。
     
    2.  反應液污染 可采用下列方法之一處理：
     
    1)DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5 U DNase I，室溫反應30 min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進行正常PCR擴增。該方法的優點是不需要知道污染DNA的序列；
     
    2)尿嘧啶糖苷酶（UNG）法 由于UV照射的去污染作用對500 bp以下的片段效果不好，而臨床用于檢測的PCR擴增片段通常為300 bp左右，因此UNG的預防作用日益受到重視和肯定。
     
    a、提取mRNA時所用的EP管、玻璃等器皿全部都要用0.1%DEPC水浸泡。然后烘干，高壓滅菌，再烘干。
     
    b、用DEPC水洗過后當然不能用雙蒸水洗了。那你用DEPC處理還有什么意義呢？還要用雙蒸水洗嗎？
     
    c、玻璃器皿干烤：180度，8小時或更長時間；小器皿也可以用少許氯仿處理一下。另外，鐵制品、研砵等也可倒上酒精直接燒。
     
    RNA提取
     
    一、RNA提取前的準備
     
    1.  研缽的處理
     
    1) 自來水反復沖洗；
     
    2) 去污劑或者洗滌靈沖洗；
     
    3) 自來水反復沖洗；
     
    4) 蒸餾水浸泡1~2d；
     
    5) 超凈工作臺內用無水乙醇沖洗2~3遍，晾干。（在RNA提取前，紫外殺菌10min）
     
    2.  槍頭及EP管的處理
     
    1) 0.1%DEPC水浸泡1~2w；
     
    2) 用鑷子夾起槍頭一一裝入槍頭盒中，用鑷子夾起EP管放入飯盒中；
     
    3) 高壓滅菌50min，45度烘箱烘干。
     
    二、RNA的提取
     
    Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA*蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑點分析，斑點雜交， Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。
     
    在收集到生物材料之后，最好能即刻進行RNA制備工作。若需暫時儲存，則應以液氮將生物材料急速冷凍后，儲存于-80 ℃冷凍柜。在制備RNA時，將儲存于冷凍柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破細胞，不可以先行解凍，以避免RNase的作用。
     
    1.  將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100 mg組織加入1 ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%；提取細胞RNA時，先離心沉淀細胞，每5-10×106個細胞加1 ml Trizol后，反復用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細胞；
     
    2.  將上述組織或細胞的Trizol裂解液轉入EP管中,在室溫15~30 ℃下放置5分鐘；然后以每1 mlTrizol液加入0.2 ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。 在室溫下（15 ℃～30 ℃）放置2～3分鐘后，12000 g（2 ℃～8 ℃）離心15分鐘；
     
    3.  取上層水相（離心后，混合物將分離為底層為淺紅的、中層為酚-氯仿相、上層為無色的水相。RNA包含在水相中，水相的體積約相當于所加的Trizol試劑量的60%）于一新的離心管，按每1 mlTrizol液加0.5 ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫（15 ℃～30 ℃）放置10分鐘，12000 g（2 ℃～8 ℃）離心10分鐘。
     
    4.  棄去上清液（RNA沉淀為一層如凝膠樣透明的小塊附在管底和管壁），按每1 ml Trizol液加入至少1 ml的比例加入75%乙醇進行洗滌，渦旋混勻，4 ℃下7500 g離心5分鐘。
     
    5.  小心棄去上清液，讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。
     
    6.  加適量Rnase-free water 溶解RNA沉淀（60 ℃ 10 min）。-70 ℃保存備用。
     
    7.  RNA可進行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70 ℃。
     
    [注意]
     
    1.  整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。另外，提取上清這步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然會有蛋白質污染，影響比值。
     
    2.  加氯仿前的勻漿液可在-70 ℃保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4 ℃保存一周，-20 ℃保存一年。
     
    在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA提取過程中注意避免mRNA 的斷裂；取2 ug進行RNA檢測，如果存在DNA污染時，要用DNase I進行消化（因為在處理過程中RNA極易降解，建議體系中加入適量RNA酶抑制劑。

     

    注意事項

     

    北京協和醫學院阜外心血管病醫院心外科心血管病國家重點實驗室吳益和分享
     
    實驗中必須堅持的一些好習慣
     
    1. 加入試劑之前，把它混勻一下，以免放置時間長了濃度不均。
     
    2. 移液槍用完之后要歸到最大計量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性。
     
    3. 所有的試劑都自己配，出了問題才好找原因一. 防止RNA酶污染的措施。
     
    一、防止RNA酶污染的措施
     
    1. 所有的玻璃器皿均應在使用前于180 ℃的高溫下干烤6 h或更長時間。
     
    2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
     
    3. 有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10 min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。
     
    4. 配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37 ℃處理12 h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經0.22 μm濾膜過濾除菌。
     
    5. 操作人員戴一次性口罩. 帽子. 手套，實驗過程中手套要勤換。
     
    6. 設置RNA操作專用實驗室，所有器械等應為專用。
     
    動植物總RNA提取-Trizol法
     
    Trizol法適用于人類. 動物. 植物. 微生物的組織或培養細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA*蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑點分析，斑點雜交， Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。
     
    在收集到生物材料之后，最好能即刻進行RNA制備工作。若需暫時儲存，則應以液氮將生物材料急速冷凍后，儲存于-80 ℃冷凍柜。在制備RNA時，將儲存于冷凍柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破細胞，不可以先行解凍，以避免RNase的作用。
     
    1. 將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100 mg組織加入1 ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%；提取細胞RNA時，先離心沉淀細胞，每5-10×106個細胞加1 ml Trizol后，反復用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細胞； 2. 將上述組織或細胞的Trizol裂解液轉入EP管中,在室溫15~30 ℃下放置5分鐘；然后以每1 mlTrizol液加入0.2 ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。 在室溫下（15 ℃～30 ℃）放置2～3分鐘后，12 000 g（2 ℃～8 ℃）離心15分鐘； 3. 取上層水相（離心后，混合物將分離為底層為淺紅的. 中層為酚-氯仿相. 上層為無色的水相。RNA包含在水相中，水相的體積約相當于所加的Trizol試劑量的60%）于一新的離心管，按每1 mlTrizol液加0.5 ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫（15 ℃～30 ℃）放置10分鐘，12 000 g（2 ℃～8 ℃）離心10分鐘。【如果希望分離DNA或蛋白質，保留中層和下層酚-氯仿相，有機相能保存在4°C一夜】
     
    4. 棄去上清液（RNA沉淀為一層如凝膠樣透明的小塊附在管底和管壁），按每1 ml Trizol液加入至少1 ml的比例加入75%乙醇進行洗滌，渦旋混勻，4 ℃下7 500 g離心5分鐘【RNA能夠在-20 °C保存在75%乙醇中至少1年，4°C保存至少1周】
     
    5. 小心棄去上清液，讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會使RNA失去溶解性，導致A260/280 ratio <1.6。
     
    6. 加適量Rnase-free water 溶解RNA沉淀，用槍頭反復吸取混勻，55-60 ℃水浴10-15 min。進行下游實驗或-70 ℃保存備用。
     
    7. RNA可進行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70 ℃。
     
    預計的總RNA產量：
     
    [注意]
     
    1. 整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。另外，提取上清這步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然會有蛋白質污染，影響比值 2. 加氯仿前的勻漿液可在-70 ℃保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4 ℃保存一周，-20 ℃保存一年。

     

     

    同實驗其他方法

    實時熒光定量PCR技術

    一、 樣品RNA的抽提 1. 取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。 2. 兩相分離 每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后

    Real-time PCR實驗攻略（基本方法一）

    實時熒光定量PCR（Real-Time PCR）實驗流程一、RNA的提取(詳見RNA提取及反轉錄)不同組織樣本的RNA提取適用不同的提取方法，因為Real-Time PCR對RNA樣品的質量要求較高

     

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