實驗材料準備：
細胞，可拍照的顯微鏡,Transwell小室,孔徑8μm,沒包被膠的Transwell,遷移實驗的細胞培養(yǎng)板24孔板。細胞培養(yǎng)板應當與購買的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,無血清的基礎培養(yǎng)基，BSA，正常的*培養(yǎng)基,無菌PBS,棉簽,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,結(jié)晶紫染液(0.1%PBS結(jié)晶紫)
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細胞侵襲實驗全步驟解析
發(fā)布時間： 2022-06-08 點擊次數(shù)： 2615次Transwell操作步驟
01
用BD公司的Matrigel 1:8或者根據(jù)細胞產(chǎn)生mmp的量來決定稀釋,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進行基底膜水化。
02
制備細胞懸液前可先用基礎培養(yǎng)基加1%的血清培養(yǎng)細胞，讓細胞饑餓12-24h,進一步去除血清的影響。
03
消化細胞,終止消化后離心棄去培養(yǎng)液,(用PBS洗1-2遍),用含0.1%的BSA的無血清培養(yǎng)基重懸及調(diào)整密度，通常調(diào)整細胞密度至5×10^5cells/ml。
04
取細胞懸液100μl加入Transwell上室, 也可以根據(jù)細胞生長速度進行調(diào)整，操作小提示：接種劑量不同的細胞，其侵襲能力是不同的，細胞量過多，穿過膜的細胞會過多過快，最后會難以統(tǒng)計結(jié)果;而細胞量過少，可能還沒到檢測的時間點，所有的細胞都已穿過，進入下室。因此最少也要保證在收樣的時候，上室內(nèi)還要有一定量的細胞存在。
05
24孔板下室一般加入600μl含生長因子或血清的*培養(yǎng)基,特別注意的是,下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生,一旦產(chǎn)生氣泡,下層培養(yǎng)液的趨化作用就會減弱甚至消失,種板時一旦出現(xiàn)氣泡,要將小室提起去除完氣泡,再將小室放進培養(yǎng)板。若是平行孔，一般設置兩組.
06
培養(yǎng)細胞:常規(guī)培養(yǎng)12-48h(主要依細胞侵襲能力而定)。24h較常見,時間節(jié)點的設置除了要考慮到細胞的侵襲力外,處理因素以及細胞數(shù)目的影響也不可忽視。
統(tǒng)計結(jié)果步驟：
01
采用直接計數(shù)法,取出Transwell小室,棄去孔中培養(yǎng)液,用無鈣的PBS洗2遍,甲醇固定30分鐘,將小室適當風干。
02
0.1%結(jié)晶紫染色20 min,用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞,注意不要蹭到已穿膜的那一層細胞，之后再用PBS洗3遍。
03
400倍顯微鏡下每個樣本取6-10個視野觀察細胞計數(shù)，取平均值，統(tǒng)計分析。
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