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    免疫細胞轉染實操時的幾大步驟說明

    發布時間: 2022-10-09  點擊次數: 676次
       對于免疫細胞轉染實驗,我們拿脂質體為例,其作為體內和體外輸送載體的工具,已經研究的十分廣泛,中性脂質體是利用脂質膜包裹DNA,借助脂質膜將DNA導入細胞膜內。帶正電的陽離子脂質體,DNA并沒有預先包埋在脂質體中,而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質體上,形成DNA-陽離子脂質體復合物,從而吸附到帶負電的細胞膜表面,經過內吞被導入細胞。
      具體實操時的步驟如下:
      1.細胞培養:取6cm細胞皿,向每孔中加入2mL含1~2×105個細胞培養液,37℃二氧化碳培養密度至40%~60%,密度過大,轉染后不利篩選細胞。
      2.轉染液在EP管中制備(為轉染每一個孔細胞所用的量):
      A液:用不含血清培養基稀釋1ug質粒DNA;
      B液:用不含血清培養基稀釋2ul脂質體。
      分別將A液與B液輕彈混勻,靜置5分鐘。
      3.吸取B液加入至A液中,輕彈混勻。室溫中置10-15分鐘。
      4.轉染準備:用1mL不含血清培養液漂洗兩次,再加入4mL不含血清培養液。
      5.轉染:把A/B復合物緩緩加入培養液中,搖勻,37℃恒溫箱置6~24小時,吸除無血清轉染液,換入正常培養液繼續培養。
      6.瞬時轉染后,可在48-72h細胞長滿之后,提取細胞蛋白或者RNA,驗證敲減/過表達效率。
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