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細胞毒性分析
發布時間: 2022-10-20 點擊次數: 1175次細胞毒性是指由細胞或化學物質引起的單純細胞殺傷事件,不依賴于凋亡或壞死的細胞死亡機理。 常用細胞毒性檢測方法有CCK-8法、MTT法、LDH法。
1、與MTT法相比:
1)CCK-8使用更為方便,無需洗滌細胞;
2)CCK-8法能快速檢測;CCK-8法的檢測線性范圍廣,靈敏度更高;
4)CCK-8法的重復性更好,MTT 實驗生成的formazan 不是水溶性的,需要使用DMSO 等有機溶劑溶解;CCK-8法產生的formazan 是水溶性的,既省去了溶解步驟,又可以減少該操作步驟帶來的誤差;
5)CCK-8法對細胞毒性小,可以保持細胞原狀態;CCK-8法試劑價格較高;2、與LDH法相比:
1)CCK-8是加在細胞中,而LDH檢測是細胞上清,這樣細胞還可以用來做其他實驗;
2)LDH法可進行高通量檢測;原理
以CCK-8法為例簡述其原理:CCK-8試劑盒中含水溶性四唑鹽WST-8 (化學名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽),WST-8在電子載體1-Methoxy PMS存在的條件下,活細胞線粒體中的脫氫酶催化WST-8生成高度水溶性的橙黃色甲瓚燃料,而甲臜染料的生成量與活細胞的數量成線性關系。
用途
1、藥物篩選實驗;
2、腫瘤藥敏試驗;
3、生物活性因子的活性檢測;
4、細胞增殖測定等;材料與儀器
【材料】細胞懸液,化合物溶液、CCK8試劑、*培養基、PBS、0.25%Trypsin-EDTA
【儀器,耗材】96孔板,二氧化碳培養箱,檢測波長450-490nm酶標儀
步驟
1、根據具體細胞類型確定其在 96 孔板種植密度,以對照組細胞密度至檢測時達到 70%-90%為參照,每組設置 3-6 個復孔,孔板邊緣空不用,加入與培養基等體積的無菌 PBS 溶液;
2. 每孔加入培養基體積 1/10的CCK-8 溶液。若起始的培養體積為 200 微升,則需加入 20 微升 CCK-8 溶液,其它情況以此類推。同時以加了相同體積細胞培養液和 CCK-8 溶液但沒有細胞的孔作為空白對照。若所用藥物會干擾檢測結果,則選加入等體積細胞培養液、藥物和CCK-8溶液但無細胞的孔作為空白對照(注意不可產生氣泡);
3. 在細胞培養箱內繼續孵育 2-4 小時,建議選取2、3、4小時后分別用酶標儀檢測,然后選取吸光度范圍比較適宜的一個時間點用于后續實驗;
4. 在 450 nm測定吸光度。如無 450 nm濾光片,可以使用 420-480 nm的濾光片。可以使用大于 600 nm的波長,例如 650 nm,作為參考波長進行雙波長測定。
注意事項
1、本實驗使用96孔板進行檢測,周圍一圈最容易蒸發,檢測會因體積不準確而增加誤差故棄用周圍一圈,加入等體積相同量的PBS、水或培養液;
2、本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應,因而還原劑(例如一些抗氧化劑)會干擾檢測,如果待檢測體系中存在較多的還原劑,需設法去除。
3、用酶標儀檢測前需確保每個孔內沒有氣泡,否則會干擾測定;
4、酚紅和血清對CCK-8法的檢測不會造成干擾,可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去;
5、試劑有一定的毒性,請穿好實驗服并戴一次性手套操作;
6、試劑要注意避光4oC或-20oC保存;
常見問題
1. 如果細胞生長較慢,且細胞較小,可以最大接種1x10^4 cells/well,但加入化合物后處理時間最長為72 h。
2. 化合物如果難溶于水,可以在培養基中適當添加DMSO、DMF以助溶,但最大濃度不宜超過0.5%,因為DMSO和DMF對細胞也有一定的毒性。如果使用DMSO、DMF助溶,需保證其他濃度的化合物DMSO、DMF的濃度也相同。
3.若吸光度值太低,怎么辦法?
1)適當增加細胞數量;
2)延長加入CCK-8溶液后的孵育時間- 下一篇:腫瘤細胞培養實驗
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