材料與儀器

D-PBSA 無血清角質形成細胞培養液 胰蛋白酶 EDTA Biocoat6孔培養板

步驟

一、材料

滅菌

無血清角質形成細胞培養液（keratinocyteserum-freemedium，KGM;Clonetics): 含有 0.15 mmol/LCa2-、0.1ng/ml 人上皮生長因子、5ug/ml 胰島素、0.5ug/ml 氫化可-的松和 30ug/ml 牛垂體提取物。

EMEM(Eagle'sminimalessentialmedium)

D-PBSA：不含 Ca2+和 Mg2+的 DulbeccoPBSA 液 FBS

胰蛋白酶和 EDTA 混合液：0.05% 胰蛋白酶，0.5 mmol/L EDTA
纖連蛋白和膠原蛋白混合液（fibronectin/collagen，FNC)：10ug/ml 纖連蛋白、35ug/ml 膠原蛋白和 lOOug/mlBSA。BSA 作為穩定劑

Biocoat 6 孔培養板：涂有鼠尾 I 型膠原蛋白（B-D Biosciences)

二、操作步驟 

原代培養 

1. 將供體角膜放于消毒過的物品上，上皮面朝上，用手術刀切成 12 個三角形組織片。應一刀切下去，避免鋸割。如此仔細處理角膜可減少對膠原蛋白基質的破壞和成纖維細胞的脫落。

2. 將角膜組織片的上皮面翻向下，放入用鼠尾 I 型膠原蛋白預涂的 6 孔培養板，每孔放 4 個組織塊。

3. 用鑷子輕壓組織片，以便使組織塊與培養皿表面充分接觸。將組織片放置 20 min，使其變干。

4. 將一滴 KGM 輕輕滴于組織片上，在 37°C 和 5%CO2 條件下孵育過夜。盡管從眼庫得到的供體角膜是用含有抗菌素的培養液（McCarey-Kauffman 或 Dexsol) 保存的，但全部操作應在無菌條件下進行。

5. 第 2 天，在培養皿中加人 lml 培養液。在培養早期，可觀察到細胞僅從角膜緣處遷出，但沒有細胞從角膜中央部或鞏膜遷出。無血清培養液含有低濃度鈣（0.15 mmol/L)，減少膠原蛋白基質降解，故這種培養液可減少成纖維細胞長出。

6 在植入角膜組織片后第 5 天，用鑷子將組織片取出，再加人 3 ml 培養液。取出組織片后，貼壁細胞繼續增殖。培養后第 2 周，細胞生長形成單層，呈現上皮具有的典型卵石狀排列特征。每個角膜約獲得 1X106?5X106 個上皮細胞。

擴增培養

7. 取出組織片后，每周換液 2 次。

8 當細胞匯合達 70%?80% 時，用 D-PBSA 浸洗細胞。然后，在 37°C 條件下用胰蛋白酶和 EDTA 混合液處理 4 min。

9. 用含有 10% FBS 的 D-PBSA 終止消化。

10 將細胞離心后，用 KGM 混懸。計數細胞，以 1X104 個/cm2 密度將細胞接種于涂有 FNC 的培養皿。

11 在 37°C、95% 空氣和 5%CO2 條件下培養。

12. 胰蛋白酶處理和種植 1d 后換培養液。

傳代后不久，上皮細胞呈長梭形，折光，遷移能力較強。傳代后第 1 周，細胞匯合達 70%?80% 時呈卵石狀排列。如果形成單層后繼續培養，細胞能生長成散在的復層結構。

盡管角膜上皮細胞能傳至 5 代，約倍增 9?10 倍，但大多數細胞增殖發生在第 1?3 代。每個角膜約獲得 1X106?2X106 個上皮細胞。細胞常在第 5 代開始衰老。