鱒魚胚胎提取物：

(a)收集胚胎（受精后 28 天的 Shasta Rainbow 或其他鱒魚種系，在 10°C 條件下飼養，或者受精后 3 天的斑馬魚，在 28°C 條件下飼養），在 -80°C 條件下凍存

(b)為了制備提取物，將約 150 g 胚胎融化后，采用 Tissuemizer 勻漿器（Tekmar ) 用 10 ml LDF 在冰上勻漿 2 min

(c)將勻漿通過數層紗布過濾后去除絨毛膜，然后在 4°C 條件下離心（20000 g，30 min )

(d)離心后收集上清液，留下表面的亮橘色脂層

(e)將上清液移入 1 只新離心管，按操作步驟（c ) 離心

(f)收集上清液，留下剩余的脂質，然后在 4°C 條件下超速離心（100000 g，60 min )

(g)超速離心后收集上清液，留下脂層。用 LDF (1 : 10 ) 稀釋上清液，然后過濾除菌

(h)提取物過一系列濾器（1.2 μm、0.45 μm和 0.2 μm )過濾

(i)將提取物按 0.5 ml 分裝后，在 -80°C 條件下凍存

(j)為了用提取物培養細胞，測量蛋白質濃度（見方案 21.4 )，然后用 LDF 將提取物稀釋至理想的工作濃度

(k)將稀釋的提取物在 4°C 條件下冷藏，最長 2 個月

BRL 細胞條件培養液：

(a)在 37°C 條件下和在 75 cm2 培養瓶中，用 DMEM/F12/10FB 培養液培養 BRL 細胞（ATCC )

(b)當細胞匯合時，用添加 2% FBS 的 LDF 置換 FD 培養液，在 37°C 條件下培養

(c)5 天后吸出 LDF，過濾，在 -20°C 凍存

(d)向細胞中加入新鮮的 LDF，5 天后重復此過程。條件化的 LDF 培養液可從同一個培養瓶中收集 3 次。然后，將細胞分開培養，使細胞再次匯合

1. 在中襄胚或早原腸胚期收集胚胎，用清潔水浸洗數次。

2. 浸洗后將胚胎移入 60 mm 皮氏皿 ( 50~100 個/皿）。然后，將皮氏皿放入層流通風櫥中，在無菌條件下放置。

3. 將胚胎放入稀漂白劑中浸泡 2 min，然后用無菌的 Holtfreter 緩沖液浸洗數次。

4. 用 2 ml 鏈酶蛋白酶 E 溶液孵育 10 min，使胚胎去絨毛膜。然后，將胚胎在皮氏皿中輕輕攪動，使胚胎與部分消化的絨毛膜分離。

5. 將培養皿傾斜，以便從一側收集胚胎，用巴斯德吸管輕輕吸出 1.5 ml 鏈酶蛋白酶溶液。為了防止去絨毛膜的胚胎黏附在皮氏皿上和破裂，保持皮氏皿傾斜，以便胚胎懸浮在剩余的鏈酶蛋白酶溶液中。

6. 加入 2 ml Holtfreter 緩沖液，輕輕攪動，以便輕輕浸洗胚胎。

7. 將皮氏皿傾斜，吸去大部分 Holtfreter 緩沖液，將胚胎懸浮在約 0.5 ml 緩沖液中。

8. 重復浸洗步驟兩次以上。

9. 在最后 1 次浸洗后，將胚胎懸浮在 0.5 ml Holtfreter 緩沖液中，然后加入 2 ml 胰蛋白酶溶液。

10. 用胰蛋白酶將胚胎孵育 1 min，然后通過用吸管輕輕吹打 3~4 次分離細胞。

11. 將細胞懸液立即移入無菌的聚丙烯離心管中，然后加入 200 μl FBS，以終止胰蛋白酶的消化作用。

12. 通過離心（500 g， 5 min ) 收集細胞，然后用無 FBS 或鱒魚血清的 LDF 原代培養液混懸細胞。

13. 將細胞以 1×104 個/cm2 的細胞密度種植到含有生長抑制的成纖維細胞飼養層的多孔培養板或培養瓶中。

14. 在加入 FBS 或鱒魚血清前讓細胞附著于飼養層（約 15 min )。在培養液中使用 10 ng/ml 人重組 LIF，此優于 BRL 條件培養液 [Sun et al.，1995a，1995b ]。

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