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    淀粉酶活性的測定

    發布時間: 2023-01-30  點擊次數: 954次

    原理

    α-淀粉酶及β-淀粉酶,各有其一定的特性,如β-淀粉酶不耐熱,在高溫下易鈍化而α-淀粉酶不耐酸,在pH3.6以下則發生鈍化,通常提取液同時有兩種淀粉酶存在,測定時,可根據它們的特性分別加以處理,鈍化其中之一,即可測出另一酶的活性。將提取液加熱到70℃維持15分鐘以鈍化β-淀粉酶,便可測定α-淀粉酶的活性?;蛘邔⑻崛∫河胮H3.6之醋酸在0℃加以處理,鈍化α-淀粉酶的活性,以測出β-淀粉酶的活性。淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖,可用3,5-二硝基水楊酸試劑測定。由于麥芽糖能將后者還原生成3-氨基-5-硝基水楊酸的顯色基團,在一定范圍內其顏色的深淺與糖的深度成正比,故可求出麥芽糖的含量,以麥芽糖的毫克數表示淀粉酶活性的大小。

    材料與儀器

    步驟

    一、 實驗材料儀器及試劑

    1、實驗材料:萌發的小麥(芽長1厘米左右)

    2、儀器:(1)小臺秤;(2)研缽;(3)容量瓶:100毫升×1;(4)具塞刻度試管25毫升×13;(5) 試管:8支;(6)刻度吸管:1毫升×2,2毫升×2;(7)離心機;(8) 恒溫水?。?(9)分光光度計。

    3、試劑:

    (1)1%淀粉溶液;

    (2)0.4 N NaOH;

    (3)pH5.6的檸檬酸緩沖液:A、稱取檸檬酸20.01克,溶解后稀釋至1升;B、稱取檸檬酸鈉29.41克,溶解后稀釋至1升。取A液13.7毫升與B液26.3毫升混勻,即為pH5.6之緩沖液。

    (4)3,5-二硝基水楊酸:精確稱取3,5-二硝基水楊酸1克溶于20毫升1N氫氧化鈉中,加入50毫升蒸餾水,再加入30克酒石酸鈉,待溶解后,用蒸餾水稀釋至100毫升,蓋緊瓶塞,勿使二氧化碳進入。

    (5)麥芽糖標準液:稱取麥芽糖0.100克溶于少量蒸餾水中,仔細移入100毫升容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度。

    二、操作步驟:

    1、酶液的提?。?br style="box-sizing: border-box; border: 0px solid; --tw-translate-x:0; --tw-translate-y:0; --tw-rotate:0; --tw-skew-x:0; --tw-skew-y:0; --tw-scale-x:1; --tw-scale-y:1; --tw-pan-x: ; --tw-pan-y: ; --tw-pinch-zoom: ; --tw-scroll-snap-strictness:proximity; --tw-ordinal: ; --tw-slashed-zero: ; --tw-numeric-figure: ; --tw-numeric-spacing: ; --tw-numeric-fraction: ; --tw-ring-inset: ; --tw-ring-offset-width:0px; --tw-ring-offset-color:#fff; --tw-ring-color:rgba(59,130,246,0.5); --tw-ring-offset-shadow:0 0 #0000; --tw-ring-shadow:0 0 #0000; --tw-shadow:0 0 #0000; --tw-shadow-colored:0 0 #0000; --tw-blur: ; --tw-brightness: ; --tw-contrast: ; --tw-grayscale: ; --tw-hue-rotate: ; --tw-invert: ; --tw-saturate: ; --tw-sepia: ; --tw-drop-shadow: ; --tw-backdrop-blur: ; --tw-backdrop-brightness: ; --tw-backdrop-contrast: ; --tw-backdrop-grayscale: ; --tw-backdrop-hue-rotate: ; --tw-backdrop-invert: ; --tw-backdrop-opacity: ; --tw-backdrop-saturate: ; --tw-backdrop-sepia: ; font-size: 1rem !important; line-height: 1.625rem !important;"/>
    稱取2克萌發的小麥種子(芽長1厘米左右),至研缽中加一克石英砂,磨成勻漿倒入25毫升具塞刻度試管中,用蒸餾水稀釋至刻度,混勻后在室溫(20℃)下放置,每隔數分鐘震蕩一次,放置15-20分鐘,離心,取上清液備用。

    2、α-淀粉酶活性的測定:

    (1)取試管4支,注明兩支為測定管。

    (2)于每管中各加酶提取液1毫升,在70℃恒溫水浴中(水溫度的變化不應超過±0.5℃)準確加熱15分鐘,在此期間β-淀粉酶受熱而鈍化,取出后迅速在自來水中冷卻。

    (3)在試管中各加入1毫升pH5.6檸檬酸緩沖液。

    (4)向對照管中加入4毫升0.4N氫氧化鈉,以鈍化酶的活性。

    (5)將測定管和對照管置40℃(±0.5℃)恒溫水浴中保溫15分鐘,再向各管分別加入40℃下預熱的淀粉溶液2毫升,搖勻,立即放入40℃水浴中準確保溫5分鐘后取出,向各測定管迅速加入4毫升0.4N氫氧化鈉,以終止酶的活動,然后準備下步糖的測定。

    3、α-淀粉酶及β-淀粉酶總活性的測定:

    取上述酶液2-6毫升,放入容量瓶中,用蒸餾水稀釋至100毫升(稀釋程度視酶活性大小而定)混合均勻后,取4支試管,各加入稀釋之酶液1毫升及1毫升pH5.6之檸檬酸緩沖液。以下步驟重復α-淀粉酶的第(4)及(5)的操作,同樣準備糖的測定。

    4、麥芽糖的測定:

    (1)取25毫升刻度試管7個,編號,分別加入麥芽糖標準液(1毫克/毫升)0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0毫升,置沸水浴中準確煮沸5分鐘,取出冷卻,用蒸餾水稀釋至25毫升,用分光光度計在520nm波長下進行比色,記錄消光值,以消光值為縱坐標,以麥芽糖含量為橫坐標繪制標準曲線。

    (2)樣品的測定:取以上各管中酶作用后的溶液及對照管中的溶液各2毫升,分別放入25毫升具塞刻度試管中,再加入2毫升3,5-二硝基水楊酸試劑,混勻,置沸水中準確煮沸5分鐘,取出冷卻,用蒸餾水稀釋至25毫升,混勻。用分光光度計在520nm波長下進行比色,記錄消光值,從麥芽糖標準曲線中查出麥芽糖含量,然后進行結果計算。

    注意事項


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