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    大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取

    發(fā)布時間: 2023-04-19  點擊次數(shù): 821次


    實驗方法原理堿法提取主要是利用共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓撲學上的差異來分離它們。在堿性pH環(huán)境,DNA變性,當恢復中性并在高鹽離子濃度時,絕大多數(shù)質(zhì)粒DNA可以準確復性,留在上清中;而線性染色體DNA不能準確復性,相互交聯(lián)纏繞附著在細胞壁碎片上與蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀。離心后獲得大量質(zhì)粒的上清液,利用親水性有機溶劑(乙醇、異丙醇、PEG8000)使質(zhì)粒DNA脫水,離心后收集。
    實驗材料
    含質(zhì)粒的大腸桿菌
    試劑、試劑盒
    葡萄糖 EDTA Tris-HCl NaOH SDS KAc 異戊醇
    儀器、耗材
    臺式高速離心機 恒溫振蕩搖床 高壓滅菌鍋 振蕩器 微量移液器 1.5ml離心管
    實驗步驟

    一、試劑配制


    1. LB液體培養(yǎng)基。


    2. 100 mg/ml氨芐西林儲存液:稱取25g的氨芐西林粉末,加去離子水至250ml,全部溶解后過濾、分裝,20℃保存。


    3. 溶液Ⅰ:50 mmol/L葡萄糖溶液,25 mmoi/L Tris-鹽酸(pH 8.0),10 mmol/L EDTA(pH 8 0)。1 mol/L Tris-鹽酸(pH 8.0)12.5ml,0 5 mol/L EDTA(pH8.0)10ml,葡萄糖4.730g;加去離子水至500ml,高壓滅菌,貯存于4℃。


    4. 溶液Ⅱ:0.2moI/L 氫氧化鈉溶液,1% SDS(10 N 氫氧化鈉20 μl,10%SDS 100μl,加去離子水至1ml),使用前臨時配制。


    5. 溶液Ⅲ(pH 4.8):5 mol/L 醋酸鉀300ml,冰醋酸57.5ml,加去離子水至500ml,4℃保存。


    6. 苯酚:氯仿(1:1,V/V)(酚和氯仿均有很強的腐蝕性操作時應(yīng)戴手套!)。


    7. 無水乙醇。


    8. 70%乙醇。


    9. RNase A(20 mg/ml)溶液:100 mg RNA酶干粉加5ml超純水溶解,然后在沸水煮


    15min,分裝,20℃保存。


    10. TE緩沖液:10 mmol/L Tris-鹽酸(pH8.0),1 mmol/L EDTA(pH8.O)。


    二、實驗方法


    1. 挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落,接種于2.0ml LB(含Amp 100 μg/ml)液體培養(yǎng)


    基中。37℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜(約12——14h)。


    2. 取1.5ml細菌培養(yǎng)液倒入離心管中,4℃、6000轉(zhuǎn)離心30s,棄上清,將離心管倒置于紙巾上,去除殘留液體。


    3. 菌體沉淀重懸于100μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅰ中,劇烈振蕩,使菌體分散混勻,室溫下放置5 min。


    4. 加入200μl新配制的溶液Ⅱ,蓋緊管口,快速溫和顛倒離心管5——10次,以混勻內(nèi)容


    物,冰浴5min。


    5. 加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口,溫和顛倒5——10次混勻,冰浴3——5min,4℃、6000轉(zhuǎn)離心5min。轉(zhuǎn)移上清到一個新的1.5ml Ep管中。


    6. 加入等體積的酚一氯仿抽提劑,振蕩混勻,4℃、6000轉(zhuǎn),離心2 rain。


    7. 小心移出上清于1.5ml Ep管中;加入2倍體積用冰預(yù)冷的無水乙醇于室溫沉淀雙鏈


    DNA,混勻,室溫放置2--5rain,4℃、6000轉(zhuǎn)離心5min。


    8. 棄上清,將離心管倒置于紙巾上使所有液體流出,加入1ml 70%乙醇,蓋緊離心管顛倒數(shù)次,4℃、6000轉(zhuǎn),離心2min。


    9. 去除所有的乙醇溶液,將管倒置于紙巾上使液體流盡,室溫干燥5——10min,直到乙醇都揮發(fā)干凈。


    10.將質(zhì)粒DNA沉淀溶于50 μl TE緩沖液(含20 μg/ml RNaseA)中,溫和振蕩數(shù)秒,-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>


    注意事項1. 溶液Ⅰ與溶菌液充分搖勻,用力適當。因為此時細菌還沒有與堿和SDS作用,染色體DNA尚未釋放,不必擔心其分子斷裂,一般可用力振蕩幾次。


    2. 加入SDS后則要注意不能過分用力振蕩,溫和混勻,但又必須讓它反應(yīng)充分。


    3. 加入溶液Ⅱ混勻之后,一定要在冰上放置,不要搖動,對于溶液Ⅲ同樣處理。


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