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    消滅 PCR 非特異性擴(kuò)增的方法

    發(fā)布時(shí)間: 2023-06-28  點(diǎn)擊次數(shù): 1077次
    非特異性擴(kuò)增,即進(jìn)行 PCR 所擴(kuò)增出來(lái)的條帶不是所要的,引物與模板在非目的條帶處有錯(cuò)配,導(dǎo)致延伸產(chǎn)物不是目的條帶。例如引物二聚體,即引物在退火過(guò)程中產(chǎn)生了 hairpin 結(jié)構(gòu)或其他二級(jí)結(jié)構(gòu),或者引物在模板的某些位置非特異性地結(jié)合,也同樣會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物都是通過(guò)引物延伸產(chǎn)生的。當(dāng)引物產(chǎn)生了二聚體或者非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物之后,引物本身就無(wú)法再延伸形成 PCR 產(chǎn)物了,這樣的情況下,非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物越是多,那目的產(chǎn)物就越是少。如果在 qPCR 過(guò)程中,就會(huì)在熔解曲線中形成雙峰。

    消滅 PCR 非特異性擴(kuò)增的方法:
    1、引物設(shè)計(jì)的過(guò)程中要用 Primer premier 5.0 來(lái)驗(yàn)證一下二聚體;
     
    2、 引物合成后,先做一次梯度 PCR,檢測(cè)最合適的退火溫度,一般高退火溫度可以提高引 物對(duì)模板的特異性從而降低引物二聚體;
     
    3、 降低 Mg2+濃度,鎂離子濃度高,會(huì)導(dǎo)致大量的非特異性擴(kuò)增,但是沒(méi)有鎂離子的話,也會(huì)導(dǎo)致 Taq 酶的失活;
     
    4、降低 dNTP 濃度,dNTP 也是非特異性擴(kuò)增的一個(gè)罪魁禍?zhǔn)祝档退臐舛龋材苡行Ы档投垠w及其他非特異性擴(kuò)增;
     
    5、降低引物濃度,一般的 PCR 引物都是過(guò)量的,降低了引物濃度自然也能降低引物之間形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性;
     
    6、提高退火溫度,這個(gè)道理很簡(jiǎn)單,引物的退火溫度提高,引物間的二級(jí)結(jié)構(gòu)形成可能性就會(huì)降低;
     
    7、延長(zhǎng)退火時(shí)間,這個(gè)也可以減弱引物間結(jié)合的可能性;
     
    8、DMSO 及甜菜堿,這些 PCR 促進(jìn)劑,主要是用于 CG 含量高的模板上,降低 DNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生,但根據(jù)經(jīng)驗(yàn),加入 DMSO 之后需要同時(shí)提高一點(diǎn)退火溫度來(lái)補(bǔ)平(qPCR 不太適用);
     
    9、熱啟動(dòng)法,通過(guò) 95℃的高溫?zé)釂?dòng),高溫解鏈,使得引物間的二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞,以此降低二聚體產(chǎn)生。


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