-
分子克隆實驗的注意事項和經驗分享
發布時間： 2024-01-16 點擊次數： 529次簡介：
分子克隆（基因克隆/DNA重組/載體構建）技術是一種在分子水平上操作的技術，用于將特定的DNA片段從供體生物中分離出來，然后通過體外重組、轉化和轉導等方法，將其插入到適合的克隆載體中，并將重組克隆載體引入到合適的寄主體內進行復制與擴增。可以應用于蛋白表達、病毒包裝、基因治療、細胞治療、mRNA疫苗、RNA干擾、細胞功能等研究。
具體操作流程：
一、聚合酶鏈式反應（PCR）
DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3'-OH末端，并以此為起始點, 沿模板5'→3'方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。
（1）PCR反應基本成分：
①模板DNA
基因組DNA上的某個基因或DNA片段；也可以是mRNA反轉錄產生的cDNA鏈。 ②引物 先由引發酶（一種特殊的RNA聚合酶）在DNA模板上合成一段RNA鏈，它提供引發末端被稱為引物，接著由DNA聚合酶從RNA引物3^端開始合成新鏈。 ③dNTPs (dATP、dCTP、dGTP和dTTP) 是PCR反應中靶DNA序列擴增的原料。在PCR反應中每種脫氧核苷三磷酸的濃度以50-200μmol/L為宜, 不能低于10-15μmol/L。 ④DNA聚合酶 該片段具有聚合酶活性和3'→5'外切核酸酶活性, 能識別和消除錯配的引物末端, 以校正復制過程中錯配的核苷酸。 通過雙鏈DNA的高溫變性 (denaturation)，目的是要使雙鏈DNA解鏈成單鏈。引物與模板的低溫退火 (annealing) ，作用是使模板DNA單鏈或上一輪的反應產物與引物相結合。適溫延伸 (extension)，引物延伸是DNA聚合酶將脫氧單核苷酸逐一地加到引物3'-OH末端, 依據模板序列合成一條互補新鏈的過程。這三步反應反復循環。每一循環中所合成的新鏈, 又都可作為下一循環中的模板。 （2）反應體系（50ul體系） 
（3）反應程序： 
二、線性化載體
在目標載體質粒上選取合適的位點進行單酶切或雙酶切，對酶切后的載體進行割膠純化。 環形雙鏈的質粒DNA分子具有三種不同的構型： ①當其兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環形結構時,稱之為共價閉合環形DNA（cccDNA）,這樣的DNA通常呈現超螺旋的SC構型； ②如果兩條多核苷酸鏈中只有一條保持著完整的環形結構,另一條鏈出現有一至數個缺口時,稱之為開環DNA（ocDNA）,此即OC構型； ③若質粒DNA經過適當的核酸內切限制酶切割之后,發生雙鏈斷裂形成線性分子（IDNA）,通稱L構型。 線性化之后的質粒比正常質粒在瓊脂糖凝膠電泳中跑的慢。 三、純化PCR、酶切產物并連接
將反應結束的產物進行純化，純化所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好，目前有多種試劑盒可供選擇；
連接線性化載體和PCR產物，可根據DNA連接酶試劑盒說明書設置，對于較大的片段可以選擇4℃連接過夜。
四、細菌轉化
冰上解凍克隆感受態細胞（DH5α）；取重組產物，加至感受態細胞中，冰上靜置30min，42℃水浴熱激45s，迅速置于冰上2-3min；加入600μL LB液體培養基,37℃搖菌1h。
五、菌落PCR 用滅過菌的 10ul 小槍頭挑取單克隆白斑至滅菌水中，振蕩混勻。然后用正常的 PCR 反應程序可。 PCR正常反應結束后用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，選擇正確條帶的菌液加入對應的培養基，37℃搖起來。
注意事項：
聚合酶鏈式反應 ①所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。 ②PCR 試劑配制應使用最高質量的新鮮雙蒸水。 ③試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。 ④PCR 的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。 質粒轉化 ①冰上解凍感受態細胞：大腸桿菌經過低溫（0度)預處理的低滲cacl2溶液，造成細胞膨脹，細胞膜通透性發生改變，即易與外源DNA相黏附并在細胞表面形成復合物。 ②熱激轉化利用氯化鈣來產生富含鈣離子的環境，從而抵消質粒DNA和細菌細胞膜之間的靜電排斥。溫度的急劇提高可以在細菌胞膜表面形成小孔，質粒DNA就可進入細菌細胞。 菌落PCR ①在做菌落 PCR 的時候，每次都要做陰性、陽性對照，陽性對照可以用抽提好的質粒或基因組，這樣可以確定 PCR 主反應液的配制沒有問題。 ②菌落PCR反應程序變性94℃4-5min即可保證外源DNA釋放出來。
安培生物致力成為推動生命科學進步值得信賴的合作者
深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術實力、先進的經營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業。總部設在廣東，服務面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術服務與合約開發為一體的專業化高科技公司，旨在為生命科學的發展提供較好的產品與服務。本公司建立了涵蓋分子生物學、細胞生物學、免疫學、信號傳導和神經科學等領域的產品供應線，在各個領域內向用戶提供較高的水平和質量穩定的產品，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶提供各種產品、技術支持與服務。
可以在第一時間為用戶提供比較先進的專業資訊和完備的產品和物流服務。 專業的技術力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產品推薦給國內從事生物學領域科研的老師和同仁。作為專業性的產品供應商，公司出資存備了大量現貨，配合優秀的銷售隊伍以及專業的技術支持，隨時為客戶提供服務。
銷售熱線
