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分子克隆實驗的注意事項和經驗分享
發布時間: 2024-01-16 點擊次數: 529次簡介:
分子克隆(基因克隆/DNA重組/載體構建)技術是一種在分子水平上操作的技術,用于將特定的DNA片段從供體生物中分離出來,然后通過體外重組、轉化和轉導等方法,將其插入到適合的克隆載體中,并將重組克隆載體引入到合適的寄主體內進行復制與擴增。可以應用于蛋白表達、病毒包裝、基因治療、細胞治療、mRNA疫苗、RNA干擾、細胞功能等研究。
具體操作流程:
一、聚合酶鏈式反應(PCR)
DNA聚合酶以單鏈DNA為模板,借助一小段雙鏈DNA來啟動合成,通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結合,形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環境下,DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3'-OH末端,并以此為起始點, 沿模板5'→3'方向延伸,合成一條新的DNA互補鏈。
(1)PCR反應基本成分:
①模板DNA
基因組DNA上的某個基因或DNA片段;也可以是mRNA反轉錄產生的cDNA鏈。 ②引物 先由引發酶(一種特殊的RNA聚合酶)在DNA模板上合成一段RNA鏈,它提供引發末端被稱為引物,接著由DNA聚合酶從RNA引物3^端開始合成新鏈。 ③dNTPs (dATP、dCTP、dGTP和dTTP) 是PCR反應中靶DNA序列擴增的原料。在PCR反應中每種脫氧核苷三磷酸的濃度以50-200μmol/L為宜, 不能低于10-15μmol/L。 ④DNA聚合酶 該片段具有聚合酶活性和3'→5'外切核酸酶活性, 能識別和消除錯配的引物末端, 以校正復制過程中錯配的核苷酸。 通過雙鏈DNA的高溫變性 (denaturation),目的是要使雙鏈DNA解鏈成單鏈。引物與模板的低溫退火 (annealing) ,作用是使模板DNA單鏈或上一輪的反應產物與引物相結合。適溫延伸 (extension),引物延伸是DNA聚合酶將脫氧單核苷酸逐一地加到引物3'-OH末端, 依據模板序列合成一條互補新鏈的過程。這三步反應反復循環。每一循環中所合成的新鏈, 又都可作為下一循環中的模板。 (2)反應體系(50ul體系) (3)反應程序: 二、線性化載體
在目標載體質粒上選取合適的位點進行單酶切或雙酶切,對酶切后的載體進行割膠純化。 環形雙鏈的質粒DNA分子具有三種不同的構型: ①當其兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環形結構時,稱之為共價閉合環形DNA(cccDNA),這樣的DNA通常呈現超螺旋的SC構型; ②如果兩條多核苷酸鏈中只有一條保持著完整的環形結構,另一條鏈出現有一至數個缺口時,稱之為開環DNA(ocDNA),此即OC構型; ③若質粒DNA經過適當的核酸內切限制酶切割之后,發生雙鏈斷裂形成線性分子(IDNA),通稱L構型。 線性化之后的質粒比正常質粒在瓊脂糖凝膠電泳中跑的慢。 三、純化PCR、酶切產物并連接
將反應結束的產物進行純化,純化所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結果,純化的方法越簡單越好,目前有多種試劑盒可供選擇;
連接線性化載體和PCR產物,可根據DNA連接酶試劑盒說明書設置,對于較大的片段可以選擇4℃連接過夜。
四、細菌轉化
冰上解凍克隆感受態細胞(DH5α);取重組產物,加至感受態細胞中,冰上靜置30min,42℃水浴熱激45s,迅速置于冰上2-3min;加入600μL LB液體培養基,37℃搖菌1h。
五、菌落PCR 用滅過菌的 10ul 小槍頭挑取單克隆白斑至滅菌水中,振蕩混勻。然后用正常的 PCR 反應程序可。 PCR正常反應結束后用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,選擇正確條帶的菌液加入對應的培養基,37℃搖起來。
注意事項:
聚合酶鏈式反應 ①所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。 ②PCR 試劑配制應使用最高質量的新鮮雙蒸水。 ③試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管,玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。 ④PCR 的樣品應在冰浴上化開,并且要充分混勻。 質粒轉化 ①冰上解凍感受態細胞:大腸桿菌經過低溫(0度)預處理的低滲cacl2溶液,造成細胞膨脹,細胞膜通透性發生改變,即易與外源DNA相黏附并在細胞表面形成復合物。 ②熱激轉化利用氯化鈣來產生富含鈣離子的環境,從而抵消質粒DNA和細菌細胞膜之間的靜電排斥。溫度的急劇提高可以在細菌胞膜表面形成小孔,質粒DNA就可進入細菌細胞。 菌落PCR ①在做菌落 PCR 的時候,每次都要做陰性、陽性對照,陽性對照可以用抽提好的質粒或基因組,這樣可以確定 PCR 主反應液的配制沒有問題。 ②菌落PCR反應程序變性94℃4-5min即可保證外源DNA釋放出來。
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