簡介：

THP-1細胞是從急性單核細胞白血病患者外周血中分離出來的單核細胞，廣泛應用于單核細胞和巨噬細胞相關機制、信號通路等研究；形態和分化特性類似于原代單核細胞和巨噬細胞，在體外，常用PMA（phorbol 12-肉豆酸酯13-乙酸酯）或1α，25(OH)2D3 (1α，25-二羥基維生素D3或vD3)誘導分化THP-1細胞為巨噬細胞。因此，THP-1單核細胞已被開發為體外極化單核細胞來源的巨噬細胞的有吸引力的模型。

原理：

一、THP-1細胞的培養方法

1.細胞復蘇

準備工作：15/50mL的離心管，馬克筆，培養瓶（T25）/培養皿（直徑60mm），RPMI 1640培養基，胎牛血清（FBS），雙抗（PS），酒精瓶（消毒殺菌）+酒精棉球，離心管/試劑管架子，移液槍，tip頭（1000/200ul）。

（1）首先用酒精棉球擦拭細胞房的實驗臺子，將我們所需要上述物品放入臺子里，并用紫外照30min，此時打開水浴鍋42℃。

（2）照完紫外后，將保存在-80℃或者液氮中的細胞拿出用一次手套包住并迅速放入42℃水浴鍋中，一般在1min中內解凍。

（3）通過傳遞箱將細胞拿進細胞房，打開照明，打開細胞臺子的玻璃門，用酒精噴灑手和細胞凍存管將細胞拿進臺子里，進行細胞復蘇。

（4）配置培養基：以50ml離心管為例：RPMI 1640培養基+10% 胎牛血清+ 1%雙抗：500ul雙抗（PS）+5mL(10%)/7.5(15%)胎牛血清（FBS）+RPMI 1640培養基加至50mL，并做好標記（培養基成分+配置時間+個人標記（名字））。

（5）首先準備一只15ml離心管，將細胞凍存管內的細胞以及凍存液吸取至離心管中，加入2mL 步驟（4）中配置好的RPMI 1640培養基，700~800rpm ，低速離心5min。

（6）離心的時間，準備T25培養瓶或者直徑60mm的培養皿做好標記（細胞名稱+復蘇時間+姓名）。離心完成后，棄上清，吸取1ml（血清）細胞培養基重懸細胞。

（7）吸取2-3ml新鮮培養基至準備好培養瓶或者培養皿中，再將1ml細胞重懸液吸取至T25瓶或培養皿，“十字"搖勻細胞。

（8）用酒精噴灑后，將細胞放入37℃，5%CO2培養箱中培養2-3天觀察細胞狀態。

注意：細胞在偏酸性環境中生長更快，當培養基稍微變黃（呈橘紅色）時，比較適合細胞生長。

2、細胞傳代

THP-1細胞為懸浮細胞且具有低密度依賴性，一般超過10^6/ml傳代，比例一般為1:3/1:4，因此目前利用的兩種傳代方式：

(1)半換液傳代（不用離心）:吸取培養瓶或者培養皿中的細胞移至新的培養瓶或者培養皿中，補足培養基2-3ml。

(2)傳統的離心傳代：將瓶子或皿中的細胞吸取至15mL離心管中，700-800rpm，離心5min；棄上清，吸取2-3ml新鮮培養基重懸細胞，分至新的培養瓶或者培養皿中并補足培養基2-3ml。

3、細胞凍存

（1）用10%DMSO：900ul FBS + 100ul DMSO （有毒小心操作）或直接用無血清細胞凍存液。

（2）收集生長狀態較好的細胞于15 mL離心管中，一般細胞數目為5×10^6-10^7/ml，700-800 rpm離心5 min，在超凈工作臺中用槍頭盡量去掉上清。

（3）加入1 mL凍存液，輕輕吹勻。將細胞放入梯度降溫盒中，放入-80℃培養箱中幾天后，轉移至液氮中進行長期保存。

注意事項或培養方面的經驗心得

（1）THP-1細胞凍存后復蘇困難，因此要保證凍存的細胞數目足夠5×10^5-10^6個cell/ml；否則細胞密度過低，復蘇后狀態不好。

（2）培養過程中如果存在細胞碎片，可等待細胞長起來后，通過低速離心去除。

（3）細胞發生少量聚團時我們可以等待THP-1細胞密度擴大后改善這種情況，但發生嚴重聚團時我們可以提高血清（FBS）用量，或者適度吹散細胞。

（4）THP-1細胞在傳代后可能會出現貼壁現象，如輕微貼壁可以輕 吹收集細胞或者丟棄貼壁的細胞，貼壁較多時，可檢查培養條件是否合適。

THP-1細胞培養過程中復蘇困難、聚團問題分析

1、復蘇困難

THP-1細胞對細胞密度具有高度依賴性。凍存時，密度一般為5×10^6-10^7/ml較為適宜；同時復蘇密度也有依賴性，建議不低于3×10^6/ml。當細胞傳過幾次代，狀態較好時，傳代密度維持在5×10^/ml-10^6/ml較為合適，超過2×10^6/ml可進行傳代。培養過程中如有細胞碎片，等細胞密度增大后可以通過低速離心去除。

2、細胞聚團嚴重

細胞聚團可能是細胞營養缺失或者受到損傷，所以共用了細胞膜，以便于彼此釋放的促進生長的因子可以被很快接收到，細胞生長一段時間后，可吹打開，離心，然后換液。另外，THP1細胞離心速度一般不要高于800rpm，實驗室常用600-700rpm，否則可能會導致細胞死亡。

（1）THP-1細胞在密度較稀時，有少量細胞聚團屬于正?，F象，我們需使用面積小的培養瓶（T25瓶）或者培養皿（直徑60mm），培養基用量也相應減少，不建議將聚團的細胞吹散，等待密度高時，細胞會自然分散開。

（2）當細胞密度高時，聚團細胞比例高于30%時，聚團嚴重。細胞間界線不清晰，細胞團模糊且較大等現象，則這種細胞聚團是異常的。此時，若對細胞沒有做過任何外界刺激或實驗處理，可檢查培養條件，一般更換優質血清或提高血清用量看是否有助于解決聚團問題。

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