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實時熒光定量PCR的優(yōu)化(三)
發(fā)布時間: 2021-10-12 點擊次數(shù): 1510次本期介紹設(shè)計引物,得到實時熒光PCR引物對,這種方法也可以用于普通PCR。
1、長度應(yīng)該在18~30bp,保證結(jié)合的特異性。
2、熔解溫度(Tm值)應(yīng)在55~60°C,兩條引物的Tm值應(yīng)相差2~3°C。
3、每條引物3'端應(yīng)該有1~3個鳥嘌呤或胞嘧啶,這樣做可以減少PCR過程中的非特異性擴增。超過3個時會起反作用,發(fā)生“滑動效應(yīng)"導(dǎo)致錯誤延伸。
4、引物的GC含量應(yīng)該在50%左右,過高的GC含量會升高Tm值。
5、引物中應(yīng)該避免反向重復(fù)序列,因為這會形成二級結(jié)構(gòu),影響引物結(jié)合在模板上。
6、如果是RT-PCR,還需要避免設(shè)計引物結(jié)合在外顯子序列上,會導(dǎo)致實驗結(jié)果假陽性。正確做法應(yīng)設(shè)計在長內(nèi)含子側(cè)翼、或短內(nèi)含子上,又或者是跨越外顯子-外顯子交界區(qū)。
7、對引物進(jìn)行脫鹽純化。
需要注意的是,有時候當(dāng)你做到了所有要點,引物還是有可能無法擴增,這時候就要重新設(shè)計引物啦。
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