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實時熒光定量PCR的優化(四)
發布時間: 2021-10-12 點擊次數: 1319次這期我們來學習設計TaqMan探針,應該考慮的因素有以下這些......
1、TaqMan探針的最佳長度在20bp,不超過30bp,這樣才能實現熒光淬滅。有些情況下超過30bp也是可以的,需要將淬滅基團設計在距離5'端18~25bp的地方。
2、TaqMan探針的Tm值要比引物的高10°C,通常在65~70°C之間,確保探針比引物先結合在模板上。
3、探針序列應該避免連續的單堿基重復序列,尤其是G,因為這可能影響探針的二級結構,降低雜交效率。
只能使用這種單堿基重復序列時,可通過肌苷替代鳥嘌呤,中斷連續。
如果是5'端有太多鳥嘌呤,也會產生不好影響,淬滅探針的熒光。
4、TaqMan探針的GC含量應該在50%。
5、探針5'端應該盡可能與3'端相似,保證Taq酶快速降解探針。
6、制備好的探針應采用HPLC純化
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