-
實時熒光定量PCR的優化(六)
發布時間: 2021-10-14 點擊次數: 1123次引物和探針的濃度也需要尋找*濃度,這通常憑借經驗決定。
為什么要尋找*濃度呢?
因為像Taqman探針在反應過程中會被破壞,需要在起始濃度便保留足量的探針。這個濃度通常是在反應體系中達到250nmol/L。但我們不能無限制的添加探針,這會增加成本,尤其是大批量檢測時,我們需要減少生產試劑的成本。
實際探索優化中,對Taqman探針法為原理的實時熒光定量PCR實驗,我們也可以使用SYBR Green I法對引物濃度進行測試,因為SYBR Green I染料能與任意雙鏈DNA結合,可以檢測到產生的引物二聚體和其他非特異性擴增產物的量。引物二聚體會降低擴增效率和特異性,我們希望找到合適的引物濃度,減少二聚體、非特異性產物的產生。
綜上,我們需要尋找引物和探針的*濃度,保證反應的靈敏度的同時,降低成本,并獲得最大特異性。
在實踐中,我們通常推薦這樣的方法來進行優化:
1、優化引物濃度時從一個標準的濃度開始優化,每次調整濃度后制作標準曲線圖,通過分析標準曲線圖判斷優化效果。推薦的標準優化濃度:Taqman探針法終濃度是500nmol/L,SYBR Green I法是200~400nmol/L。
2、引物濃度效果評判的標準:標準曲線是線性的,且效率>80%,可以認為濃度是合適的,就不需要進一步優化了。
- 下一篇:什么是多重PCR?
- 上一篇:實時熒光定量PCR的優化(五)