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慢病毒載體——構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株的利器
發(fā)布時間: 2021-10-20 點擊次數(shù): 1471次隨著病毒生物學(xué)的發(fā)展,諸多病毒載體已成為了在各種實驗中進行核酸轉(zhuǎn)運的重要工具,主流的病毒載體主要包括:慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒。其中,慢病毒的應(yīng)用較為廣泛。
什么是慢病毒
慢病毒的英文是Lentivirus,它的命名有兩層含義。一方面,Lenti-在拉丁文中有慢的意思;另一方面,被慢病毒感染的患者早期很難觀察,大多都會經(jīng)歷一個長達數(shù)年的潛伏期,之后才緩慢發(fā)病,因此這些病原微生物被稱之為慢病毒。
它是逆轉(zhuǎn)錄病毒科下的一個屬,其主要包括8種能夠感染人和脊椎動物的病毒,原發(fā)感染的細胞以巨噬細胞和淋巴細胞為主,最終導(dǎo)致感染個體發(fā)病。其典型特征為其RNA基因組能逆轉(zhuǎn)錄為cDNA副本,cDNA副本又能穩(wěn)定整合至宿主細胞基因組中(這就是常說的穩(wěn)轉(zhuǎn))。
慢病毒
慢病毒的基因組都很復(fù)雜,編碼一系列不同于其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的調(diào)控蛋白,這使得它們具有*的調(diào)控途徑和病毒持久性機制。
慢病毒的基因結(jié)構(gòu)
各類慢病毒的基因結(jié)構(gòu)
所有的逆轉(zhuǎn)錄病毒都至少含有這三種基因:gag、pol和env,它們編碼結(jié)構(gòu)蛋白和酶(逆轉(zhuǎn)錄酶,RNase H,整合酶,和蛋白酶),這是病毒復(fù)制所必需的。然而,慢病毒包含額外的基因,這些基因?qū)τ谟行У牟《緩?fù)制和持久性是定不可少的。如原型慢病毒HIV-1,編碼了6個額外的基因(tat、rev、vif、vpu、vpr和nef)。HIV-2和SIV缺乏vpu基因,但包含一個叫做vpx的基因。非靈長類的慢病毒含有較少的這些額外基因,但都包含了tat和rev基因,它們分別負責(zé)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄激活病毒基因表達。
HIV-1作為慢病毒的代表,其結(jié)構(gòu)具有一定的特點。它是一個單鏈的RNA病毒,其由9個基因所構(gòu)成,gag、pol、env3個基因編碼病毒的基本結(jié)構(gòu),tat、rev2個調(diào)節(jié)基因,vif、vpr、vpu、nef 4個輔助基因。gap基因可以編碼病毒所需的核心蛋白;pol基因編碼病毒復(fù)制所需要的酶;env基因編碼病毒的包膜糖蛋白,并且可以決定病毒感染宿主的靶向性。rev基因編碼的蛋白調(diào)節(jié)gag、pol、env的表達水平,tat編碼的蛋白參與RNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié),此外兩端為長末端重復(fù)系列,一般簡稱其為LTR,內(nèi)含復(fù)制所需的順式作用原件。
慢病毒的特點
1. 感染范圍廣
慢病毒可有效感染分裂和非分裂細胞,適合幾乎所有細胞系,如神經(jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、干細胞等。
2. 可穩(wěn)定表達
慢病毒可將外源基因整合到宿主細胞基因組上,不隨著細胞的分裂傳代而丟失,大大提高目的基因或目的shRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,能夠方便快捷地實現(xiàn)基因的長期、穩(wěn)定表達。
3. 操作安全性高
慢病毒采用的是自失活復(fù)制缺陷型病毒株,保障操作安全。
慢病毒的應(yīng)用
通常,對慢病毒的利用,更多是通過慢病毒載體來進行的。慢病毒載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體,該載體可以將外源基因有效地整合到宿主的染色體上,從而達到外源基因的持久性表達。此外,這一載體區(qū)別于一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,即可以將轉(zhuǎn)基因技術(shù)整合到分裂和非分裂細胞的基因組中。
慢病毒載體包含了包裝、感染、穩(wěn)定整合所需要的全部遺傳信息,是慢病毒載體系統(tǒng)的主要組成部分。攜帶有外源基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細胞系的輔助下,經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒,將其進行收集和濃縮后可直接感染宿主細胞或者動物模型,實現(xiàn)外源基因在細胞或活體組織中表達。
許多研究者在研究基因功能時,會進行基因干擾和基因過表達,讓實驗結(jié)論更嚴(yán)謹。基因過表達和干擾分別是指通過慢病毒感染細胞的方式,使目的細胞過量表達或沉默某特定基因,從而實現(xiàn)基因的功能增強或減弱。基因過表達和干擾作為一種傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)至今依然在生物學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。
我們針對難轉(zhuǎn)染的細胞,建立了標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)服務(wù)體系,可為您提供過表達、干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的構(gòu)建服務(wù)。結(jié)合高效的慢病毒系統(tǒng),我們可以準(zhǔn)確地將您的目的基因和示蹤基因插入到目的細胞基因組中,得到穩(wěn)定表達或沉默特定基因的細胞株。
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