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細(xì)胞培養(yǎng)附著物知多少
發(fā)布時(shí)間: 2021-10-20 點(diǎn)擊次數(shù): 1924次在實(shí)驗(yàn)室中,我們一般會(huì)用聚丙乙烯制成的無菌培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或多孔板來培養(yǎng)細(xì)胞。它們透光性好、生長面平滑、能夠提供質(zhì)地均勻、重復(fù)性好的單層培養(yǎng)物。然而由于是人工合成的,因此聚丙乙烯是疏水性的,表面不適宜細(xì)胞生長,故用于組織培養(yǎng)的塑料,都要經(jīng)過γ射線照射、化學(xué)處理或電離輻射,以產(chǎn)生親水的帶電表面,使細(xì)胞能夠附著。附著遇到的最大困難是如何讓細(xì)胞附著上去,而包被附著物有可能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的粘附。
在很多時(shí)候,為了適應(yīng)不同實(shí)驗(yàn)的需求、解決細(xì)胞貼壁不牢的問題,我們需要對(duì)培養(yǎng)器皿用不同的物質(zhì)進(jìn)行包被后使用。這些物質(zhì)可以是膠原、纖連蛋白或一些其他基質(zhì)產(chǎn)物,尤其在培養(yǎng)原代細(xì)胞及3D細(xì)胞培養(yǎng)中,運(yùn)用更為廣泛。
1聚合物
科學(xué)家們發(fā)現(xiàn),在缺乏血清條件下,克隆細(xì)胞必須以濃度為1mg/ml的多聚賴氨酸包被培養(yǎng)皿,同樣的技術(shù)也可以促進(jìn)神經(jīng)突觸的生長。其中,多聚-D-賴氨酸(PDL)異構(gòu)體優(yōu)于多聚-L-賴氨酸(PLL),因?yàn)榍罢卟蝗菀妆患?xì)胞外液蛋白酶水解,但目前兩者都在使用。
Poly-L-lysine的中文名為多聚賴氨酸,簡稱PLL,是通過鏈霉菌屬的細(xì)菌菌株自然發(fā)酵生產(chǎn)聚賴氨酸。
貼壁依賴性細(xì)胞,通過包被帶正電的高分子多聚賴氨酸,可以提高無血清或低血清培養(yǎng)環(huán)境下的細(xì)胞貼壁率,加強(qiáng)培養(yǎng)器皿表面對(duì)血清蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的吸附,加快細(xì)胞的增殖。
多聚賴氨酸(ScienCell,貨號(hào):0403/0413)包被多適用于神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng),能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化和神經(jīng)突的生長。
2膠原和明膠
膠原(collagen)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多的一類蛋白質(zhì),廣泛存在于從低等脊椎動(dòng)物的體表面到哺乳動(dòng)物機(jī)體的一切組織中。它是支持細(xì)胞和組織生長的重要胞外基質(zhì)蛋白,其形成的胞外環(huán)境有利于多種細(xì)胞的粘附、生長、遷移和分化。用變性膠原處理后能改善多種細(xì)胞的附著能力,如上皮細(xì)胞;而天然未變性的膠原可能是細(xì)胞分化功能表達(dá)所必需的。
明膠是一種大分子非均質(zhì)親水膠體,是膠原部分水解后得到的水溶性蛋白多聚體,明膠與膠原具有同源性。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn),包被明膠有利于肌肉細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)。
明膠溶液(ScienCell,貨號(hào):0423)與多聚賴氨酸一樣,也是一種粘附劑,涂覆在容器表面可以促進(jìn)細(xì)胞貼壁生長。推薦用于培養(yǎng)分化的人類胚胎干細(xì)胞、某些原代細(xì)胞和永生化細(xì)胞。
明膠因其具有較高的生物相容性、生物可降解性且體內(nèi)降解后不產(chǎn)生其他副產(chǎn)物、無免疫原性和血液相容性以及具有與膠原相同的組分和生物性質(zhì),也廣泛應(yīng)用于組織工程和藥物遞送系統(tǒng)中。
3基質(zhì)成分
基質(zhì)成分包括層粘連蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白等,其中許多是天然產(chǎn)物,如果化學(xué)成分不*明確,則需要一定的純化。當(dāng)然,細(xì)胞外基質(zhì)中的許多成分都可以作為重組蛋白使用,因此成分明確,可以純化。
纖連蛋白(Fibronectin, FN),也稱為纖維連接蛋白,是一種廣譜的、天然的細(xì)胞粘附因子。它主要由肝臟及血管內(nèi)皮細(xì)胞生成,廣泛存在于血漿、多種細(xì)胞表面及細(xì)胞基質(zhì)中,一種高分子量的非膠原性糖蛋白,分子含糖量4.5-9.5%可以與血纖蛋白、肝素、膠原、DNA以及細(xì)胞表面受體結(jié)合,而且具有多種細(xì)胞生物學(xué)功能,廣泛參與細(xì)胞的遷移、粘附、增殖、止血及組織修復(fù)的過程。
常用于細(xì)胞培養(yǎng)的纖連蛋白一般為牛血漿纖維粘連蛋白(ScienCell,貨號(hào):8248)或人纖連蛋白(ScienCell,貨號(hào):8488;貨號(hào):CSP044)。
纖連蛋白作為細(xì)胞培養(yǎng)的基質(zhì),可提高多種細(xì)胞的貼壁率、匯合率,縮短細(xì)胞匯合時(shí)間,使細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)良好,代謝率增強(qiáng),DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成速度顯著提高;細(xì)胞的集落率升高,原代培養(yǎng)成活率提高。
4細(xì)胞外基質(zhì)
雖然表面有惰性包被已經(jīng)足夠了,但仍然有必要利用合適的單層細(xì)胞培養(yǎng)物為某些特殊細(xì)胞類型提供合適基質(zhì)。如用去污劑去除匯合的小鼠成纖維細(xì)胞(3T3)、人成纖維細(xì)胞(MRC-5)等的單層細(xì)胞后,殘留的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)能促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的分化、研究腫瘤細(xì)胞行為及血管形態(tài)發(fā)生。
5飼養(yǎng)層
基質(zhì)覆蓋有助于細(xì)胞的附著、生長和分化。但對(duì)于一些較難培養(yǎng)的細(xì)胞,尤其是低細(xì)胞密度下更難培養(yǎng)的細(xì)胞,需要活細(xì)胞來維持。原因可能是成纖維細(xì)胞的代謝物滲漏,或是成纖維細(xì)胞分泌生長因子對(duì)培養(yǎng)基的補(bǔ)充,也可能由于細(xì)胞產(chǎn)物優(yōu)化了細(xì)胞的附著面。生長成匯合單層細(xì)胞的飼養(yǎng)層可為其他細(xì)胞附著提供一個(gè)合適的甚至是選擇性的表面。例如,單層神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以促進(jìn)中樞和外周神經(jīng)元的存活及生長,雖然這種情況是由擴(kuò)散因子而不是直接的細(xì)胞接觸引起的。
飼養(yǎng)層細(xì)胞大部分可用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF),而飼養(yǎng)層細(xì)胞大都用于培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞。
6非黏性附著物
當(dāng)然,有時(shí)我們不希望細(xì)胞附著生長,例如培養(yǎng)非貼壁依賴性的細(xì)胞(懸浮細(xì)胞)時(shí),可通過將細(xì)胞接種到瓊脂中的方法來實(shí)現(xiàn),因?yàn)樵谶@些基質(zhì)中未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不易形成集落。目前較為常用到的是瓊脂、瓊脂糖或Methocel(甲基纖維素)。前兩種為凝膠,第三種為高粘度溶膠。因?yàn)榧谆w維素是溶膠,細(xì)胞可以在其中緩慢下沉,因此經(jīng)常在其下面放一層瓊脂。在非組織培養(yǎng)基的器皿上不涂瓊脂層也能達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)的目的,但有時(shí)會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞附著和鋪展。
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