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    免疫熒光技術-間接法

    發布時間: 2021-10-26  點擊次數: 1557次
    材料與儀器:

    抗體
    PBS 伊文氏蘭
    顯微鏡


    實驗步驟:

    1. 標本固定后,PBS洗滌3x3 分鐘;

    2. 滴加一抗,37 ℃40 分鐘或4 ℃過夜;

    3. PBS洗3x3 分鐘;

    4.  滴加熒光標記二抗37 ℃,40 分鐘;

    5.  PBS洗3x3 分鐘;

    6.  0.1 %伊文氏蘭復染;

    7.  PBS洗3x3 分鐘;

    8.  緩沖甘油封片,鏡檢。


    要點:
    1.種屬在進行雙重免疫標記時,要選擇來源于兩種不同種屬動物的一抗,如選擇來源于rabbit和mouse的抗體,二抗則用帶有不同熒光素標記的,如抗rabbit或抗mouse二抗, FITC和Tex-Red;
    2.孵育時間和溫度相同的兩種一抗可以同時孵育,然后加入相對應的一抗的二抗進行孵育,一抗孵育時間室溫至少需要16h,二抗孵育室溫不宜超過4h,選擇4℃孵育比較好,背景比較清晰,另外孵育時夏天特別注意室溫溫度;
    3.抗體稀釋液通常第一抗體選擇1%牛血清白蛋白進行稀釋,第二抗體選擇用0.01mol/L的PBS稀釋。



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