欧美精品成人A在线观看,麻豆国产AV超爽剧情系列,97人妻天天摸天天爽天天,精品人妻无码AV一区二区

銷售熱線

19126518388
  • 技術(shù)文章ARTICLE

    您當(dāng)前的位置:首頁 > 技術(shù)文章 > 免疫熒光(Immunofluorescence, IF)實驗方法

    免疫熒光(Immunofluorescence, IF)實驗方法

    發(fā)布時間: 2021-10-26  點擊次數(shù): 1795次
    材料與儀器:
    免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán),再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位,以及利用定量技術(shù)(比如流式細(xì)胞儀)測定含量。


    實驗步驟:
    免疫熒光實驗的主要步驟包括細(xì)胞片制備、固定及通透(或稱為透化)、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細(xì)胞片制備(通俗的說法是細(xì)胞爬片)是免疫熒光實驗的第一步,細(xì)胞片的質(zhì)量對實驗的成敗至關(guān)重要,原因很簡單,如果發(fā)生細(xì)胞掉片,一切都無從談起。這一步關(guān)鍵的是玻片(Slides or Coverslips)的處理以及細(xì)胞的活力,有人根據(jù)成功經(jīng)驗總結(jié)出許多有益的細(xì)節(jié)或小竅門,非常值得借鑒。固定和通透步驟最重要的是根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒ǎ线m的固定劑和固定程序?qū)τ讷@得好的實驗結(jié)果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步驟是類似的,最重要的區(qū)別在于免疫熒光實驗中要用到熒光抗體,因此必須謹(jǐn)記避光操作,此外抗體濃度的選擇可能更加關(guān)鍵。最后需要注意的是,標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片應(yīng)盡早觀察,或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存,以免因標(biāo)記蛋白解離或熒光減弱而影響實驗結(jié)果。


    由于操作步驟比較多,同時在分析結(jié)果時無法像WB那樣可以根據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識別,所以要得到一個好的免疫熒光實驗結(jié)果,除了需要高質(zhì)量的抗體,以及對實驗條件進(jìn)行反復(fù)優(yōu)化外,還必須設(shè)立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒瀸φ铡?傊庖邿晒鈱嶒瀼募?xì)胞樣品處理、固定、封閉、抗體孵育到最后的封片及觀察拍照,每步都非常關(guān)鍵,需要嚴(yán)格控制實驗流程中每個步驟的質(zhì)量,才能最終達(dá)到你的實驗?zāi)康摹?/p>

    (1) 細(xì)胞準(zhǔn)備。對單層生長細(xì)胞,在傳代培養(yǎng)時,將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片,PBS洗兩次;對懸浮生長細(xì)胞,取對數(shù)生長細(xì)胞,用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次,用細(xì)胞離心甩片機制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。

    (2) 固定。根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5 min.
    (3) 通透。使用交聯(lián)劑(如多聚甲醛)固定后的細(xì)胞,一般需要在加入抗體孵育前,對細(xì)胞進(jìn)行通透處理,以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.
    (4) 封閉。使用封閉液對細(xì)胞進(jìn)行封閉,時間一般為30min.
    (5) 一抗結(jié)合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次,每次沖洗5min.
    (6) 二抗結(jié)合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次,每次沖洗5min后,再用蒸餾水漂洗一次。
    (7) 封片及檢測。滴加封片劑一滴,封片,熒光顯微鏡檢查。
    (一)細(xì)胞準(zhǔn)備
    用于免疫熒光實驗的細(xì)胞可以是直接生長在蓋玻片上的貼壁細(xì)胞,也可以是經(jīng)過離心后涂片的懸浮細(xì)胞或者是將取自體內(nèi)的組織細(xì)胞懸液離心后涂片。貼壁良好的細(xì)胞一般在培養(yǎng)時直接放入coverslips讓細(xì)胞生長在其上即可,盡量避免使用貼壁性能不好的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光實驗,以免后續(xù)的漂洗操作引起細(xì)胞脫落。少數(shù)實驗需要使用這類細(xì)胞或者懸浮細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光觀察,建議使用細(xì)胞離心甩片機制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。



產(chǎn)品中心 Products