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從大鼠肝臟制備微體的方法
發布時間: 2021-11-16 點擊次數: 979次材料與儀器
雄大鼠
蔗糖 蔗糖 HM
玻璃板步驟
1. 用斷頸法殺死約 150 g 重的雄大鼠,大鼠的數量取決于要制備的粗微體的數量。由于一個 150 g 重的大鼠肝(6 g)大約每克肝蛋白含有 10 mg 粗微體,所以大鼠的數量可以以回收率為 50% 來進行估計。
2. 流干血液后,打開腹部和胸腔,切取肝,將它們放在盛有冰冷勻漿介質的燒杯中:
勻漿介質(HM):
0.5 mol/L 蔗糖
1 mmol/L DTT
3. 用冰冷 HM 沖洗大鼠肝,將它們放在紙巾上,如果有結締組織去掉之,迅速稱重。
4. 將肝放在干凈的玻璃板上,用剃須刀片將其切成盡可能小的碎片,直到形成漿糊樣稠狀物。當肝在小燒杯里用剪刀剪碎時,不加HM 要容易些,因為 HM 妨礙剪切。
5. 將切碎的肝放入盛有 4~5 倍體積冰冷 HM 的燒杯中,輕輕混旋,等碎片沉到底部后去掉液體以去除血液。
6. 4 倍體積的 HM 在配套寬松的 Dounce 勻漿器(帶兩個研杵的 40 ml Dounce 勻漿器)中輕輕杵擊 5~10 次(上下各一次為一次杵擊),或者在 Potter-Elvdijem 玻璃/Teflon 勻漿器(0.04~0.06 英寸清除率;Kontes)中用馬達帶動的 Teflon 研杵以 1700 r/min 的速率勻漿(5~10 次杵擊),將勻漿物保持在冰水里。
7. 將勻漿物經過 4~6 層用 HM 預先濕潤過的干酪紗布過濾到刻度量筒中。過濾結束后,將沙布的邊沿合到一塊,慢慢地從口部到底部擠壓袋子。
8. 將勻漿物體積增加到肝重量的 5 倍,用石蠟封口膜蓋注,倒轉量筒數次以混勻勻漿物。
9. 在 Sorvall 低溫冷凍離心機的 SS34 轉頭中 2500 r/min 離心勻漿物 5 分鐘,然后提高速度到 15000 r/min(最大 23000 g)離心 15 分鐘。
10. 用紙巾、吸管或注射器和金屬針頭將表面的一層白色東西吸去,然后用注射器和金屬針頭將上清(PMS ) 轉移到刻度量筒中。
11. 用 PMS 和 2.5 mol/L 蔗糖制備三種蔗糖溶液。
(1) 1.35 mol/L 含 PMS 的蔗糖(用 1 體積的 PMS 和 0.7 體積的 2.5 mol/L 蔗糖混合制備)
(2) 1.55 mol/L 含 PMS 的蔗糖(用 1 體積的 PMS 和 1.1 體積的 2.5 mol/L 蔗糖混合制備)
(3) 1.8 mol/L 含 PMS 的蔗糖(用 1 體積的 PMS 和 2 體積的 2.5 mol/L 蔗糖混合制備)
12. 用第 11 步制備的溶液在 Ti60 轉頭(Beckmanlnslrmnents) 的超離心管中制備分級梯度。自上而下鋪上 5 ml 1.8 mol/L 蔗糖-PMS、3 ml 1.55 mol/L 蔗糖-PMS、15~17 ml 1.35 mol/L蔗糖-PMS,最后是 2~3 ml 1 mol/L 蔗糖溶液。
13. 4℃ 48000 r/min(最大 240000 g)離心至少 6 小時。
14. 用注射器和金屬針頭收集沉降在 1.55 mol/L 蔗糖溶液的兩條帶或一條彌散帶中的膜結構,這就是粗微體部分,可以用于以后的各種目的。
15. 制備 TKM 緩沖液和高速離心上清(HSS)
(1) 制備 TKM 緩沖液
① TKM 緩沖液
50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5)
50 mmol/L KCl
5 mmol/L MgCl2
② TK20M 緩沖液
50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5
50 mmol/L KCl
20 mmol/L MgCl2
(2) 用 2 倍體積 0.25 mol/L 蔗糖-3 mmol/L DTT 或 0.25 mol/L 蔗糖-TKM- 3 mmol/L DTT 溶液勻漿切碎的肝。
(3) 15000 r/min 離心勻漿物 15 分鐘,取出并保存上清。
(4) 上清在 Ti60 轉頭中 4℃ 45000 r/min ( 最大 200000 g ) 離心 60 分鐘。
(5) 取出并去掉最上面的脂肪層,從上面取出 4/5 的液體作為內源性 RNase 抑制劑(HSS),分裝并保存在 -70℃。
(6) 如果要進行體外翻譯,用 G100 凝膠層析柱從大鼠肝 HSS 中制備 G100 部分。
16. 按下列方法處理粗微體部分。
(1) 制備膜結合多聚核糖體
① 用含 HSS ( 20% v/v) 的 TK20M 將粗微體部分稀釋 3 倍,與 Triton X-100 和 DOC ( 終濃度分別為 1% 和 0.5% ) 混合,放冰上 10 分鐘。
② 將混合物鋪在制備于 Ti60 轉頭離心管中的分級梯度上,該梯度(自下而上)含有 5 ml 2.0 mol/L 含有 HSS (10% v/v) 或人胎盤核糖核酸酶抑制劑 ( 2~4 U/ml ) 的蔗糖-TK20M 溶液、3 ml 1.55 mol/L 含有 HSS (10% v/v) 的蔗糖-TK20M 溶液和 15~18 ml 去污劑處理的粗微體部分。
③ 4℃ 44000 r/min ( 最大 200000 g)離心梯度 14~16 小時。
④ 將上清倒掉,立即用 3~5 ml TKM 沖洗離心管的內管壁(將緩沖液加到管壁上而不要直接加到多聚核糖體沉淀上,輕輕混旋并棄掉上清)。將離心管倒立在干凈紙巾上數分鐘,用 Kimwipe 紙巾輕察內管壁,保存在 -70℃ 待用。
(2) 用粗微體進行體外 35S 甲硫氨酸摻入
① 要濃縮粗微體,用含 HSS ( 10% v/v) 的 TKM 稀釋粗微體 4 倍,在 SW41 轉頭的離心管里準備(自下而上)含有 1 ml 含 HSS 的 1.8 mol/L 蔗糖-TKM,1 ml 含 G100 部分的(20% v/v ) 的 1.3 mol/L 蔗糖-TKM 和 2 ml 含 HSS (10% v/v ) 的 0.7 mol/L 蔗糖-TKM 的梯度,在該梯度上鋪 8 ml 稀釋的粗微體。
② 4℃ 35000 r/min ( 最大 210000 g)離心梯度 60 分鐘。
③ 收集在 1.8 mol/L 和 1.3 mol/L 蔗糖界面之間形成的條帶,體積要盡可能小以免降低微體的濃度,立即用于 G100 系統的翻譯(Gaetani et at.1983)。
(3) 對于不要求完整的膜結合多聚核糖體的實驗
① 用 TKM 稀釋粗微體 3 倍,在 Ti60 轉頭中 4℃ 40000 r/min ( 最大 160000 g)離心 60 分鐘。
② 倒掉上清,將管子立于一疊紙巾上數分鐘,用 Kimwipe 紙巾輕擦內壁,保存于 -70℃ 待用。- 下一篇:從狗的胰臟中制備粗微體
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