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細胞勻漿的操作
發布時間: 2021-11-24 點擊次數: 3318次材料與儀器
細胞
緩沖鹽溶液 二異丙基氟瞬酸 勻漿緩沖液
相差顯微鏡步驟
1. 準備下面的貯液和材料。
等滲的緩沖鹽溶液(例如 PBS,150 mmol/L NaCl;10 mmol/L NaPO4,pH 7.2)
二異丙基氟瞬酸(DIFP)
1 mol/L 咪唑-HCl,pH 7.0
0.5 mmol/L K+EGTA,pH 7.0
0.1 mol/L K+ATP,pH 7.0
0.1 mol/L DTT
NaN3
蛋白酶抑制劑
PMSF
抑胃酶肽 A
亮抑酶肽
刀豆胰蛋白酶抑制劑
勻漿緩沖液:
0.34 mol/L 蔗糖
20 mmol/L 咪唑-HCl,pH 7.0
5 mmoI/L K+EGTA,pH 7.0
5 mmol/L K+ATP,pH 7.0
5 mmol/L DTT ( 干粉或用貯存液)
50 μmol/L PMSF
3 mmol/L NaN3
22 μmol/L 抑胃酶肽 A
1.2 μmol/L 亮抑酶酞
10 μmol/L 刀豆胰蛋白酶抑制劑
PMSF 可以用 pAPMSF 代替,它更穩定,但更貴。
2. 洗細胞:輕輕地沉降細胞(例如 3000 g 離心 5 分鐘),去掉培養基,通過振搖打碎沉淀物,然后重懸于至少 10 倍體積冰冷的等滲緩沖鹽水中。再次在新鮮的等滲緩沖鹽水中沉降和重懸,總共 3 次。對于不同的細胞類型,離心力和時間應該進行優化。
3. 最終的冰冷的細胞懸液中補加 DIFP,使終濃度為 5.7 mmol/L(每毫升細胞懸液中加 1 μl)。冰浴 5 分鐘。
4. 上述的步驟 2 沉降細胞,然后重懸于 4~6 倍勻漿緩沖液中。
5. 細胞勻漿要造成最大破壞,但要盡量減少氧化。
6. 用相差顯微鏡檢測細胞的裂解,證實超過 99% 都已經裂解了。- 下一篇:如何做非肌肉肌球蛋白的層析純化?
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