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如何做非肌肉肌球蛋白的層析純化?
發(fā)布時(shí)間: 2021-11-24 點(diǎn)擊次數(shù): 900次材料與儀器
非肌肉肌球蛋白
勻漿緩沖液 肌動(dòng)蛋白聚合緩沖液 凝膠過濾 羥基磷灰石緩沖液 GF HT 緩沖液
大容量轉(zhuǎn)頭步驟
高速離心和 DEAE 層析
1. 用不含除了 PMSF 以外的蛋白水解抑制劑的勻漿緩沖液平衡 DEAE 纖維素,取 50 ml 裝到 2.5cm x 35cm 有合適管路的柱子上。
2. 準(zhǔn)備總體積為 0.8 L,線性梯度為 0~0.5 mol/L KCl 的勻漿緩沖液。
3. 用大容量轉(zhuǎn)頭(例如 Ti 647.5,它帶 6 個(gè) 70 ml 容量的聚碳酸酯桶)以 43000 r/min,137600 g 超速離心 2 小時(shí),從已勻漿的細(xì)胞中沉淀細(xì)胞碎片。
4. 盡可能多地轉(zhuǎn)移清亮的上清,不要弄碎沉淀和浮在表面的白色脂肪殘?jiān)?br style="border: 0px solid; box-sizing: border-box; --tw-shadow:0 0 #0000; max-width: 100%; background-image: none !important; background-position: initial !important; background-size: initial !important; background-repeat: initial !important; background-attachment: initial !important; background-origin: initial !important; background-clip: initial !important; font-size: 0.32rem !important; line-height: 0.48rem !important; margin: 0px !important;"/>
5. 混合 100 ml 上清和 100 mI DEAE-纖維素(已如上所述用勻漿緩沖液預(yù)先平衡)可以一次性地把清亮的上清樣到 DEAE 上。DEAE-蛋白混合物倒進(jìn) 2.5cm x 35cm 的預(yù)先裝了 50 ml 用勻漿緩沖液和 PMSF平衡的 DEAE-纖維素的柱子。
6. 立即開始分部收集(每管 8.5 ml )。
7. 用 3~5 倍體積的勻漿緩沖液洗柱子,用 0.8~1 升 KCl 梯度為 0~0.5 mol/L 的勻漿緩沖液進(jìn)行洗脫。
8. 分析柱子中肌球蛋白的 ATP 酶活性(K+EDTA 或 Ca2+ 活性峰)、SDS-PAGE、免疫印跡、ELASA 或放射標(biāo)記及固相結(jié)合分析.
9. 把從 DEAE 層析得到的含肌球蛋白的收集液混合在一起。
非肌肉肌球蛋白和外源肌肉肌動(dòng)蛋白共沉淀
10. 準(zhǔn)備下列貯存液。
1 mol/L KCl
0.1 mol/L MgCl2
溶于不含 ATP 的肌動(dòng)蛋白聚合緩沖液的 30% 蔗糖墊層:
300 mg/ml 蔗糖
50 mmol/L KCl
2 mmol/L MgCl2
10 mmol/L 嘧唑-HCl,pH 7.0
11. 計(jì)算所需的外源肌動(dòng)蛋白量,使混合的 DEAE 收集液中肌動(dòng)蛋白的終濃度為 0.125 mg/ml。所需肌動(dòng)蛋白體積(ml)由下式給出:
VA= ( 0.125 x Vpool)/ [ ( 肌動(dòng)蛋白)-0.125]
( 肌動(dòng)蛋白)是在緩沖液 A 中 G-肌動(dòng)蛋白貯存液的濃度,單位 mg/ml。
12. 量出所需 G-肌動(dòng)蛋白的量(使用 1~8 mg/ml 溶于緩沖液 A 中的肌動(dòng)蛋白,用肌動(dòng)蛋白制備中所述的方法獲得),并通過和適當(dāng)體積的 50x 肌動(dòng)蛋白聚合緩沖液(所加的體積=VA/50)混合并在室溫培養(yǎng) 10~20 分鐘來使它聚合。
50x 肌動(dòng)蛋白聚合緩沖液:
2.5 mol/L KCl
1 mol/L MgCl2
3 mmol/L NaN3
13. F-肌動(dòng)蛋白和 DEAE 收集液混合(步驟 9 ),使 MgCl2 濃度為 2 mmol/L。
14. 加入足量的 1 mol/L 葡萄糖使終濃度為 50 mmol/L ( 加 50 μl/ml ),然后加己糖激酶使終濃度為 1 單位/ml(0.25 μl/ml)。室溫下攪拌 5 分鐘,然后轉(zhuǎn)移到 0℃ 過夜(幾小時(shí)可能就足夠了)。
15. 在超速離心管中裝 1/3 溶于不含 ATP 的肌動(dòng)蛋白聚合緩沖液的 30% 蔗糖墊層,把含僵硬的肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物的樣品鋪到墊層上面。離心 3 小時(shí)沉淀肌動(dòng)球蛋白。
通過不連續(xù)凝膠過濾從外源肌動(dòng)蛋白中分離肌球蛋白
16. 準(zhǔn)備用于凝膠過濾的貯存液和材料
4x 凝膠過濾/羥基磷灰石緩沖液:
200 mmol/L 咪唑-HCl,pH 7.0
20% 蔗糖
8 mmoI/L K+EDTA,pH 7.0
12 mmol/L NaN3
可以貯存在 4℃。
2x GF/HT 緩沖液:
4X GF/HT 緩沖液,100 ml
0.1 mol/L K+ATP,pH 7.0,10 ml
DTT,62 mg
用 dH2O 加到 200 ml 。
KI 凝膠過濾緩沖液:
2x GF/HT 緩沖液,20 ml
Kl,4.78 g
用 dH2O 加到 40 ml。
KCl 凝膠過濾緩沖液:
2x CF/HT 緩沖液,180 ml
KCl,16.10 g
用 dH2O 加到 360 ml。
17. 備一個(gè) 1.5 x 85 cm 的用 KCl 凝膠過濾/羥基磷灰石緩沖液平衡了的 A15-m 瓊脂糖凝膠過濾柱。
18. 離心步驟結(jié)束的時(shí)候,在凝膠過濾柱上加 12~19 ml KI 緩沖液。
19. 倒掉上清和蔗糖,留下肌動(dòng)球蛋白沉淀物,然后在冰庫中把管子倒轉(zhuǎn)在紙巾上 5~10 分鐘,小心地使液體流干。用棉簽去掉多余的液體。
20. 處理沉淀:
(1) 用不銹鋼刮刀挖出沉淀。
(2) 在 4.3 ml KI 緩沖液中用一個(gè) 7 ml 的帶緊的研杵的 Dounce 勻漿器進(jìn)行勻漿。
(3) 超速離心(50Ti 轉(zhuǎn)頭,30000 r/min 63400 g)30 分鐘使樣品變清。
(4) 仔細(xì)地轉(zhuǎn)移上清,不要帶任何沉淀碎片。
(5) 立即把樣品加到凝膠過濾柱上并用 KCI 凝膠過濾緩沖液跑柱子。
21. 分析柱子中肌球蛋白的 ATP 酶活性、SDS-PAGE、免疫印跡、ELASA 或放射標(biāo)記及固相結(jié)合分析。混合含肌球蛋白的收集液。洗脫天然肌球蛋白-II 的分配系數(shù)應(yīng)該是 0.13~0.14。
羥基磷灰石層析
22. 準(zhǔn)備進(jìn)行羥基磷灰石層析的貯存液和材料。
預(yù)先在 GF/HF 緩沖液中平衡了的羥基磷灰石(2~4 ml)
線性梯度,總體積 20~40 ml 的 GF/HF 緩沖液,0~300 mmol/L K+PO4,pH 7.0
0.6 mol/L K+PO4,pH 7.0
23. 準(zhǔn)備一個(gè) 1x 5 cm 的有合適管路的柱子。
24. 對(duì)收集液的進(jìn)一步純化是重復(fù)肌動(dòng)蛋白親和及凝膠過濾步驟或接著用經(jīng)基磷灰石層析。
25. 收集液和預(yù)先平衡好的羥基磷灰石(每毫升羥基磷灰石 12~20 ml 收集液)混合在一起,然后旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過夜(短一點(diǎn)時(shí)間可能也夠)。
26. 把蛋白/羥基磷灰石混合物倒到一個(gè)小柱子(1x5 cm) 中,用 5~10 倍體積的 CF/HF 緩沖液洗,然后用總體積 20~40 ml 的 GF/HF 緩沖液,0~300 mmol/L K+PO4 線性梯度,pH 7.0 洗脫。肌球蛋白Ⅱ在大約 200~220 mmol/L K+PO4,pH 7.0 處洗脫下來。- 下一篇:核提取物的制備方法
- 上一篇:細(xì)胞勻漿的操作
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