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    核提取物的制備方法

    發(fā)布時(shí)間: 2021-11-24  點(diǎn)擊次數(shù): 1289次

    材料與儀器

    轉(zhuǎn)瓶或單層培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如HeLa細(xì)胞)
    PBS 低滲緩沖液 高鹽緩沖液 含1. 2 mol L KCl 透析緩沖液 液氮
    貝克曼 JS4. 2 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)子 50 mL 圓錐形刻度聚丙烯離心管(對(duì)較小體積的提取物也可用 15 mL 的離心管) Dounce 氏玻璃勻漿器(B 型研杵) Beckman JA-20 離心轉(zhuǎn)子或相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)子磁性攪拌器或傾斜臺(tái) Beckman JA-20 離心轉(zhuǎn)子或相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)子磁性攪拌器或傾斜臺(tái)、 管型透析膜(14000 MWCO)、電導(dǎo)計(jì)

    步驟


    1a) 收集轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞:將 5× 108?10× 108 細(xì)胞置 1 L 的塑料瓶 1850 g 離心 20 min。輕輕倒去上清并丟棄,將細(xì)胞轉(zhuǎn)入50 mL 錐形刻度離心管中(每管 2?3 L 培養(yǎng)液中的細(xì)胞)。進(jìn)行步驟 2。


    1b) 收集單層培養(yǎng)的細(xì)胞:?jiǎn)螌蛹?xì)胞長(zhǎng)滿后去掉培養(yǎng)液。用足量 PBS 洗 1 次,PBS 用 量為沒過細(xì)胞,輕輕振蕩,棄 PBS。將細(xì)胞刮入新鮮 PBS 液里,倒進(jìn)錐形刻度離心管中。進(jìn)行步驟 2。


    2) 1850 g 離心 10 min。進(jìn)行步驟 3a 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)或步驟 3b 單層培養(yǎng)。


    3a) 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞:輕輕倒出上清并棄掉。用離心管上的刻度測(cè)量壓緊后細(xì)胞的體積 (Pcv)將細(xì)胞重懸于約 5 倍于其 pcv 的 PBS 液中。1850 g 離心10 min。進(jìn)行步 驟 4。


    3b) 單層培養(yǎng)細(xì)胞:輕輕倒出上清并棄掉。用離心管上的刻度測(cè)量 pcv, 進(jìn)行步驟 4。


    4) 快速地將沉淀的細(xì)胞重懸于 5 倍體積的低滲緩沖液中1850 g 離心 10 min 并棄掉上 清。


    5) 將細(xì)胞沉淀重懸于 3 倍于原 pcv 的低滲緩沖液中,放置在冰上 10 min,讓細(xì)胞腫脹。


    6) 將細(xì)胞轉(zhuǎn)到 Dmmce 氏玻璃勻漿器中,用 B 號(hào)研杵上下抽提 10 次。用臺(tái)盼藍(lán)染色排斥法在顯微鏡下檢査細(xì)胞裂解情況(應(yīng)大于80%?90%)。


    7) 將細(xì)胞轉(zhuǎn)到離心管中。用 JS4.2 轉(zhuǎn)子 3300 g 離心 15 min 收集細(xì)胞核。保留上清用來制備 S-l00 細(xì)胞質(zhì)提取物。


    8) 用離心管上的刻度測(cè)量第 7 步離心壓緊后的細(xì)胞核體積(pnv)。用 l/2 pnv 體積的低鹽緩沖液重懸細(xì)胞核。


    9) 在輕輕攪拌的同時(shí),逐滴加入1/2 pnv 體積(見步驟 8) 的高鹽緩沖液。必要時(shí)用 Dounce 氏玻璃勻裝器混勻。


    10) 不斷輕輕攪拌 30 min 以提取核內(nèi)容物。


    11) 用 Beckman JA-20 轉(zhuǎn)子 25 000 g 離心 30 min 以收集核提取物。倒出上清并測(cè)量其電導(dǎo)率(見步驟 12),這就是核提取物。


    12) 將核提取物加入透析管中,用夾子至少封住透析袋的一端;透析袋一端是打開的, 這樣就可以測(cè)量透析袋內(nèi)核提取物的電導(dǎo)率,比較核提取物電導(dǎo)率和透析液電導(dǎo)率 的不同,以確定是否需要進(jìn)一步透析。在 50 倍體積的透析液中進(jìn)行透析,直到提 取物的電導(dǎo)率和透析液一致為止(即提取物的 KCr 濃度達(dá)到 100 mmol/L 時(shí))。盡量縮短透析時(shí)間。


    取 5?10 μl 提取物用水稀釋至 1 mL 用來測(cè)電導(dǎo)。用電導(dǎo)測(cè)量?jī)x直接讀出稀釋液的電導(dǎo)值,與同樣稀釋的透析液的電導(dǎo)值相比較。


    13) 將提取物從透析袋中移出,最后一次檢測(cè)其電導(dǎo)率以確定透析已經(jīng)完成。將提取物25000 g 離心 20 min, 棄掉沉淀。


    14) 測(cè)定上清中蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)需要分裝,浸入液氮中速凍,-80℃保存。



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