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大鼠視神經少突膠質細胞培養實驗——牛血清培養法
發布時間: 2021-12-06 點擊次數: 1003次材料與儀器
Wistar大鼠
亞(石西)酸鈉 腐胺 轉鐵蛋白 胰島素 甲狀腺素 黃體酮 谷氨酰胺 小牛血清 兔抗鼠GC抗體
眼科剪 滴管 離心機 培養皿 CO2培養箱步驟
一、實驗步驟
1. 取新生2 d 的Wistar大鼠10 只,無菌條件下取出雙側視神經。2. 接種至24孔培養板內經多聚賴氨酸處理的蓋玻片上。3. 加入含30g·L-1 小牛血清的DMEM/F12 培養基,37℃,50mL/L CO2,100%濕度連續培養3 d 。4. 3 d 后棄廢液,改為含 5g·L-1 小牛血清DMEM/F12 條件培養液繼續培養。5. 每周換液2次。在獲得足夠的細胞數量后,改用無血清條件培養液繼續培養,每2 d 換液一次。
二、形態學觀察
每天在倒置顯微鏡,觀察培養細胞的生長過程和形態學變化并拍照。
三、免疫細胞化學鑒定
1. 將含細胞蓋玻片取出,0.01 mol·L-1 PBS沖洗3 次x5 min。
2. 冷丙酮固定10 min。
3. PBS沖洗(3 次x5 min)。
4. 30g·L-1 過氧化氫室溫孵育15 min。
5. PBS沖洗3 次x5 min。
6. 滴加正常山羊血清,室溫孵育20 min。
7. 滴加1:100 GC抗體,陰性對照以PBS代替一抗,37℃孵育60 min。
8. PBS沖洗3 次x5 min。
9. 滴加 生物素標記羊抗兔IgG,37℃,20 min。
10. PBS沖洗3 次x5 min。
11. 滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液。
12. DAB工作 液顯色,自來水終止反應。
13. 脫水,透明,DPX封片保存。
四、結果1. 形態學觀察結果
組織塊24 h 開始貼壁,48~72 h 可見神經組織邊緣游出少量細胞,主要為圓形或梭形(圖 1)。8~9 d 左右,細胞基本鋪滿培養孔。此時改用無血清條件培養基培養進行純化。培養過程中,部分細胞死亡。12 d 左右獲得的細胞胞體基本為呈圓形或多角型,直徑約 6~10μm。細胞核較大,胞質少(圖 2)。
2. 免疫組織化學染色結果
培養的視神經少突膠質細胞的免疫組織化學染色 GC 蛋白陽性,未加一抗的呈陰性。染色結果顯示成熟的少突膠質細胞突起豐富,互相形成蜘蛛網狀(圖 3)。蘇木素復染,異質細胞較少,90%以上為陽性細胞(圖 4)。
Figure 1 Cells migrated from optic nerve tissue at the third day (10x10)圖 1. 培養第 3 天,細胞自視神經遷出 (10x10)Figure2 Purified oligodendrocytes of optic nerve at the fifteenth day (10x40)圖 2. 培養第 15 天,純化的視神經少突膠質細胞(10x40)Figure 3 Positive expression of GC in oligodendrocytes at the seventh day (10x20)圖 3. 培養第 7 天,少突膠質細胞 GC 陽性表達 (10x20)Figure 4 Positive expression of GC in purified oligodendrocytes at the fifteenth day (hematoxylin staining) (10x20)圖 4. 培養第 15 天,純化的少突膠質細胞 GC 陽性表達(蘇木素復染)(10x20)- 下一篇:大鼠胰島細胞培養實驗
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