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變性凝膠電泳實驗
發布時間: 2021-12-14 點擊次數: 962次材料與儀器
DNA
乙醇 異丙醇 二甲基二氯硅烷 TEMED 變性丙烯酰胺溶液 SDS
電泳儀 注射器 巴斯德吸管 干膠機步驟
1. 制作每塊凝膠時,首先要用肥皂及水小心嚴格地清洗兩塊30 cm×40 cm的前后玻璃平板,用去離子水沖洗后晾干,用噴射洗瓶噴10%乙酵或異丙醇使平板濕海。
2. 然后用Kimwipe紙或其他無絨紙巾將平板擦干。
3. 戴手套在通風櫥工作,用浸濕了含5%二甲基二氯硅烷的氯仿溶液的Kimwipe紙在每片平板的其中一面加一層此溶液,并小心洗擦拭整面平板。
4. 待硅化層干后,用Kimwipe紙以70%乙醇或異丙醇擦凈并干燥,最后再檢查平板有沒有灰塵或其他物質。5. 按廠商指南用0.2~0.4 mm 均厚的墊片和大的書本裝訂夾子組裝凝膠膠模夾層,注意墊片與平板的邊、底壓緊對齊。
6. 制作每塊凝膠時,在100 ml 燒杯配制60 ml 所需的變性丙烯酰胺凝膠溶液,在灌膠(步驟7)前,*混勻60 μl TEMED和0.6 ml 10%過硫酸銨于每份丙烯酰胺溶液中。7. 立即灌膠,用60 ml 注射器小心吸出丙烯酰胺溶液,避免吸入氣泡,讓短平板朝上, 并使凝膠平板夾層與臬面成45度角,沿著平板的一邊慢慢將丙烯酰胺溶液推入兩片平板之間,其間可調整角度讓膠液慢饅流入夾層的一邊。
8. 當溶液達到短平板的頂部時,放下膠模夾層至其頂部邊緣離操作臺平面仍有5 cm 左右,其下墊一空的吸頭盒或其他物件以使之保持較低的角度。
9. 將0.2~0.4 mm 厚的鯊魚齒樣品梳的平齊一側插入膠液中,至短平板下約2~3 mm,操作須十分小心以避免產生氣泡,用一個書本裝訂夾將平極之間的樣品梳夾緊,以避免在掩子與平板間形 成凝膠固塊。
10. 加一層過量的丙烯酰胺溶液至梳子,保證其被*覆蓋。用水沖洗注射器,除去過量的丙烯酰胺。
11. 除去每片膠模夾層的底部墊片或膠帶,用刀片除去樣品瓶周圍的過量聚丙烯酰胺凝膠。
12. 用水清洗平板表面溢出的尿素和丙烯酰胺溶液,從每片膠模夾層中撥去鯊魚齒樣品梳,避免拉傷凝膠頂部。
13. 用水清洗梳子,準備好在步驟16操作時重新插回樣品孔。如果用常規樣品梳,小心防止撕裂聚丙烯酰胺加樣孔,14. 凝膠電泳裝置的下層貯液槽加入1XTBE緩沖液,使凝膠夾層能浸泡在2~3 cm 的一層緩沖液中,放入凝膠夾層并用夾子固定在電泳裝置上。
15. 上層貯槽倒入1×TBE緩沖液,使超過凝膠頂部約3 cm,用巴斯德吸管或Beral細管以1×TBE清洗凝膠頂部。16. 將清洗干凈的鯊魚齒樣品梳重新播回凝膠夾層,使其齒部僅可觸及凝膠,用巴斯德吸管或Beral細管以1×TBE緩沖液*清洗加樣孔,以除去零星的聚丙烯酰胺碎片。17. 加樣前,在45 V/cm 凝膠的電壓降下預電泳,使凝膠預熱,即在1 700 V,70 W 恒功率下電泳約30 min。
18. 在加樣前,清洗加樣孔除去浸進孔中的尿素。19. 在甲酰胺/染料溶液中的樣品,蓋好蓋子,在95℃加熱2 min,然后置于冰上,每孔加 樣2~3 μl 測序用的加樣吸頭可于每次加樣后在下槽緩沖液中沖洗2次后繼續使用。
20. 在45~70 W 恒功率下電泳,凝膠溫度保持在約65℃。
21. 高于此溫度可能會造成玻璃平板炸裂或條帶彌散,而太低溫度可使測序產物不*變性、現察標志染料的遷移以確定電泳時間。
22. 將干冰加入干膠機的冷阱并預熱至80℃。
23. 電泳完畢時,排出上下液槽的緩沖液,并按放射性廢物處理丟棄液體。
24. 從電泳裝置中取出凝膠夾層,并在冷自來水下沖洗直至兩面玻璃平板表面都冷卻為止,將夾層平放在紙巾上,四口玻璃平板(短平板)朝上,除去多余的液體及夾子、膠帶,取出一邊的墊片。
25. 兩片玻璃平板之間插入一個長金屬鏟子,輕輕轉動鏟于將玻璃 平板橇起使之分開,凝膠應貼在下面的玻璃平板,如果貼在上面的平板,則將它翻轉過來。
26. 從插有鏟子的一邊饅慢提起上面的平板,遂漸增加角度直至上層平板*與凝膠分離。27. 一旦平板分離后,取去另一邊的墊片及除去凝膠周圍多余的聚丙烯酰胺碎片。28. 如果樣品含32P或33P,固定步驟可用可不用。如果樣品含33S,直接將凝膠連同玻璃平板一起放入淺托盤中,輕輕覆蓋一層約2 cm 的5%乙酸 / 5%甲醇固定液,浸泡10~15 min,不時輕輕搖動托盤使凝膠與玻璃平板松開。29. 將疑膠重新置于平板上,靠吸力或重力除去固定液注意保持凝膠處于平極的中央, 小心從托盤中將平板連同凝膠取出,放在工作平臺上。
30. 將兩張干的轉印紙,疊齊如 同一張一祥,從凝膠的一端開始緩慢地向另一端放下,貼在凝膠的表面,小心防止在紙和凝膠間形成氣泡。
31. 從平板上剝起轉印紙,凝膠應和它一起被揭起,逐漸卷起紙,而凝膠就同它一起被剝離平板。
32. 將濾紙和凝膠放在預熱的干膠機中,上面覆蓋一張保鮮瞑,80℃處理20 min ~1 h,使凝膠*干燥。33. 從干膠上揭去保鮮膜,將干膠放在X光曝光盒中,Kodak XAR-5X光膠片直接與凝膠接觸,室溫放射自顯影,經足夠時間曝光后(一般需過夜)取出X光膠片并沖印。常見問題
變性聚丙烯酰胺凝膠中相對于示蹤染料的寡核苷酸的遷移
同實驗其他方法
電解質梯度測序膠
1. 按基本方案步驟1~22灌制凝膠及進行預電泳,但上槽緩沖液為0.5×TBE,下槽為1×TBE。 2. 按基本方案步驟23~26步準備樣品及加樣。 3.
含甲酰胺的測序膠
1. 按基本方案步驟1~5組裝凝膠平板夾層。 2. 按所需濃度配制甲酰胺凝膠溶液,加熱輕輕挽拌使之溶解,冷卻至30℃以下。 3. 加入0.15 ml TEMED
緩沖液梯度測序膠
1. 按基本方案步驟1~5組裝凝膠平板夾層。 2. 在2個100 ml 燒杯中,配制緩沖液梯度凝膠溶液:50 ml 用0.5×TBE配制,25 ml 用2.5×TBE配制
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