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    哺乳動物細胞基因穩定轉染的實驗

    發布時間: 2021-12-14  點擊次數: 783次

    材料與儀器


    哺乳動物細胞
    *培養液
    培養箱 離心管


    步驟


    1.  確定所要轉染的細胞系能呈獨立集落生長。對于貼壁細胞,在10 cm 組織培養培養皿中接種約100個細胞,培養10~12天,毎4天換液1次。亞甲藍染色后對成活的細胞集落進行計數。

     
    2.  確定母代細胞的選擇條件:將一培養皿上生長匯片的細胞按不小于1:15的比例分傳于含有不同藥物濃度的培養液中。培養10天。用合適的選擇培養液每4天換液1次, 并檢查活細胞。
     
    3.  確定轉染母代細胞的*的方法??蛇x用磷酸鈣或電穿孔方法。對于磷酸鈣轉染,在加DNA的前1天,將母代細胞按1:15分傳中*培養液中。
     
    4.  用目的基因轉染母代細胞,含目的基因的質粒與含標記基因的質粒的摩爾比例不小于5:1。用擔體DNA替代含有目的基因的質粒作為對照,分別進行幾次轉染。
     
    5.  在無選擇條件下讓細胞倍增2次。將細胞按1:15分傳于選擇培養液中。
     
    6.  在選擇培養液中接種5個以上培養皿,以得到盡可能多的能挑取和擴增成細胞系的細胞集落數,每4天用選擇培養液換液,培養10~12天,將培養皿對著光成一角度觀察其中的細胞克隆,其中的一只培養皿直可進行染色以便于計算細胞集落數。挑取大的、生長良好的細胞集落。


    注意事項


    如果用5:1的比例,沒有必要在轉染前將透擇標記基因與目的基因連接起來:如果選擇需要用大量的選擇性質粒,有時無態保證5:1比例,故要將選擇標記基因及所要研究的目的基因構建在同一個質粒中。如果用含有所研究的基因進行轉染沒有形成克隆,而在含有的對照中卻可產生究隆,則所研究的基因能有細胞毒性。


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