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    備擇方案 3 長期細(xì)胞標(biāo)記

    發(fā)布時間： 2022-03-10　　點擊次數(shù)： 899次

    原理

    長期標(biāo)記意味著對細(xì)胞進(jìn)行 6～32 h 持續(xù)的代謝標(biāo)記。該方法特別適用于研究合成速度相對較慢的蛋白質(zhì)或研究成熟的標(biāo)記蛋白而不是生物合成的前體。穩(wěn)定狀態(tài)的標(biāo)記是長期標(biāo)記的一種形式，在此過程細(xì)胞和放射性標(biāo)記的氨基酸一起孵育直至放射性標(biāo)記蛋白的合成和降解速率相當(dāng)。如果蛋白質(zhì)復(fù)合體中的亞基的初級結(jié)構(gòu)已知，該方法可以對這些亞單位進(jìn)行化學(xué)計量。所加入的未標(biāo)記的甲硫氨酸量依賴于某些因素，如標(biāo)記的時間和細(xì)胞濃度。通常使用的培養(yǎng)基中含有 5％～20％ 正常的非標(biāo)記甲硫氨酸含量。

    材料與儀器

    細(xì)胞懸液／貼壁細(xì)胞 [35S]標(biāo)記L-甲硫氨酸（>800 Ci／mmol)／[35S]標(biāo)記蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物
    PBS(冷凍) 37℃ 長期標(biāo)記培養(yǎng)基
    75 cm2 組織培養(yǎng)瓶

    步驟

    1. 在預(yù)熱的 37℃ 長期標(biāo)記培養(yǎng)基中制備 0.02～0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液（見基本方案步驟 1）。


    2.1 對于懸浮細(xì)胞：用預(yù)熱的長期標(biāo)記培養(yǎng)基準(zhǔn)備并洗細(xì)胞一次（見基本方案步驟 2）。


    在 25 ml 0.02～0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液中重懸 0.5 ×107～2 ×107 細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到 75 cm2 組織培養(yǎng)瓶中。


    2.2 對貼壁細(xì)胞： 75 cm2 組織培養(yǎng)瓶中生長 0.5 ×107 ～2 ×107 的貼壁細(xì)胞（80% ～90%融合），在 CO2 培養(yǎng)箱中。用預(yù)熱的長期標(biāo)記培養(yǎng)基洗細(xì)胞一次（見備擇方案 1 步驟 3）。每個 75 cm2 組織培養(yǎng)瓶中加入 25 ml 0.02～0.1 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸工作溶液。


    3. 擰緊蓋子以防 [35S] 標(biāo)記的化合物揮發(fā)。在 CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 16 h。


    4. 洗細(xì)胞并測定摻入量（見基本方案步驟 5～7；或備擇方案 1 步驟 6～8）

    注意事項

    常見問題

    同實驗其他方法

    氨基酸代謝標(biāo)記實驗

    1. 室溫融化 [35S] 標(biāo)記甲硫氨酸，并用預(yù)熱的（37℃）脈沖標(biāo)記培養(yǎng)基制備 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。2. 室溫下 300 g 離心 5 min，獲得懸液中 0.5 × 107~

    備擇方案 1 對貼壁細(xì)胞

    1. 在 100 mm 組織培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞到 80%~90% 融合（0.5 × 107~2 × 107 細(xì)胞，取決于細(xì)胞類型）。2. 如上所述制備 [35S] 甲硫氨酸的工作液體（見基本方案步驟 1

    備擇方案 2 示蹤標(biāo)記細(xì)胞

    1. 每個時間點和每個樣品準(zhǔn)備 0.5 × 107 ~2 × 107 細(xì)胞， 每 0 .5 × 107 ~2 × 107 細(xì)胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脈沖標(biāo)記

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