原理：

 CO-IP（免疫共沉淀）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X，那么與X結合的蛋白質Y也能沉淀下來。

 從原理示意圖可見，免疫共沉淀利用抗原（紅三角）與蛋白 (藍圓柱) 的特異性結合，再通過連接著樹脂的抗體 (紫圓球) 去識別抗原，從細胞裂解液或者蛋白混合物中捕獲與抗原相作的蛋白。之后通過進一步洗脫，獲取抗原-蛋白復合物，再對蛋白進行檢測。

一、蛋白樣品制備

裂解提取出免疫沉淀需要的蛋白樣品，以下為HEK293T細胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關文獻。

單層貼壁細胞總蛋白的提取：

1、收集細胞：10cm細胞培養板上，每板細胞加1ml ，4℃預冷的PBS（0.01 M pH7.2～7.3）。反復沖洗把所有掛壁細胞洗下來轉移到1.5ml離心管內 離心：3400 rpm 2min。

2、清洗細胞：棄上清，（大槍頭套小槍頭）避免吸到沉淀。再加1mPBS，垂懸吹打；離心：rpm3400 2min。棄上清，將PBS吸凈后-80℃保存。

3、準備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠。

4、裂解蛋白，收集的細胞中加入1000ul細胞裂解液10ul蛋白酶抑制劑，冰上靜置30min，每10min震蕩混勻一次，4℃，12000rpm離心10min，收集上清液。

5、 每1 ml 總蛋白中加入100 μl Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃1 h以去除非特異性雜蛋白，降低背景。

6、4℃，14000g離心15min，將上清轉移到一個新的離心管中標號Input，留Protein A珠子，標號IP。

7、變性以及還原蛋白

室溫溶解蛋白上樣緩沖液（5×），按照4 uL蛋白樣品+1 ul (5×)的比例混合，IP組加入50ul蛋白上樣緩沖液，在蛋白樣品中加入含SDS（保證樣品中的所有蛋白帶電荷一致）的上樣緩沖液，100℃加熱煮沸，以充分變性蛋白。冰上驟冷，上樣到SDS-PAGE膠加樣孔即可。

二、經過SDS-PAGE分離樣品

膠的選擇與制備（根據目的蛋白的大小，選擇合適的分離膠的濃度）

1、凝膠的制備:根據目的蛋白的大小來選擇合適濃度的分離膠。目的蛋白小于20 k Da選擇12%~15%的分離膠;大于20 k Da選擇10%的分離膠, 濃縮膠一般固定為5%。

2、上樣加入蛋白樣品，每孔加上樣液20ug，留一孔加預染的marker。

3、加滿電泳緩沖液，蓋上槽蓋，接通電源，先用70V恒壓電泳，約30min,當指示劑溴酚藍進入分離膠后改用90V恒壓電泳，當指示劑到達距凝膠下端約0.5cm處時關閉電源，取出膠板。

（注意：上樣時間盡量短，避免樣品擴散，但也不能過快避免樣品溢出而造成相鄰加樣孔的交叉污染，未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液）

三、轉膜、封閉、一抗、二抗孵育

將蛋白凝膠中的蛋白，通過電流作用轉移到轉印膜上。

1、將剪好的PVDF膜用無水甲醇潤濕30秒以上，然后用dd H2O漂洗2min,浸泡于轉移緩沖液中5min后開始后續操作。

2、裝配轉膜三明治結構（在轉移緩沖液中制備三明治可以避免氣泡的產生）

黑面（負極）→海綿墊→3層濾紙→凝膠→轉印膜→3層濾紙→海綿墊→紅面（正極），每層之間不能有氣泡。然后將三明治轉移至電泳槽中，黑面對黑面。

3、加入轉膜緩沖液，將電轉儀置于冰水中，300mA恒流轉膜60-90min。

4、轉膜結束后，使用5% 脫脂奶粉室溫封閉1h。

5、選擇合適的一抗孵育，室溫搖動1h。

6、孵育二抗，4℃孵育2h或室溫（22-25℃）搖動孵育1h。（抗體查相應說明書確定稀釋倍數）

四、顯影

1、配置稀釋液，將A液和B液按照（1：1）混合。

2、從TBST緩沖液中取出膜，去除膜上的多余緩沖液，但不要讓膜干燥。

3、將有蛋白的一面朝上平整的鋪在一張紙板上，加上配好的工作稀釋液。用量以覆蓋住膜為基準。

4、將膜與工作稀釋液孵育1-5min,確保整個表面覆蓋。

5、去除多余的液體，用保鮮膜包好PVDF膜，暗室中X膠片感光顯影定影。

注意：

1、一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經過預實驗確定最佳條件。

2、顯色液必須新鮮配置使用，最后加入 H2O2。

3、DAB 有致癌的潛在可能，操作時要小心仔細。

五、注意事項

1、上樣時，要迅速，避免樣品擴散，也不能讓樣品溢出而造成相鄰加樣孔的交叉污染。

2、全程操作中戴手套，不要用手觸膜。

3、如檢測小于20kD的蛋白應用0.2µm的膜，并可省略轉移時的平衡步驟。

4、 某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫，此時可用1.0% BSA代替Tween-20。

5、如要同時檢測大分子量和小分子蛋白，最好用梯度膠分離蛋白。

6、曝光時。去除膜上的多余緩沖液，但不要讓膜干燥，顯影液要現用現配。

7、PVDF 膜上一抗二抗可以使用洗脫液洗脫，重新孵育一抗二抗。

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